鸡桑叶总黄酮提取工艺优化及抗氧化活性研究

陈建福

（漳州职业技术学院应用化工学院，福建 漳州 363000）

鸡桑（MorusaustralisPoir）是桑科桑属落叶灌木或小乔木，其耐寒、耐旱、抗风，是我国野生桑树的主要品种之一，在全国大部分省区均有分布［1-2］。鸡桑是药食两用植物，其果实、叶、根、皮等皆可入药，具有疏散风热、平肝明目、凉血、清肺润燥等功用，可用于外感风热所致的发热、头痛、咳嗽、咽喉肿痛等症状［3-4］。鸡桑叶中含有大量氨基酸、黄酮、多糖、维生素和生物碱等天然有效成份［5］，其中黄酮是广泛存在于植物体内的一种多酚类物质，具有抗肿瘤、抗抑郁、抗氧化和抗衰老等多种生理活性功能［6-7］，但目前国内外对鸡桑叶相关有效成分的提取与应用还比较少，其经济价值还需进一步去挖掘。本研究以鸡桑叶为原料，先对影响鸡桑叶总黄酮提取率的工艺因素进行了单因素实验，再利用Box-Behnken设计对提取工艺进行响应面优化，最后评价了鸡桑叶总黄酮的抗氧化活性，为鸡桑叶总黄酮的提取与应用奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 原料与试剂

鸡桑叶采自福建省漳州市芗城区芝山公园，经漳州职业技术学院园艺专业王水琦教授鉴定为桑科桑属植物鸡桑（Morus australisPoir）；乙醇，食品级，河南鑫河阳酒精有限公司；芦丁标准品，UV≥98%，上海金穗生物科技有限公司；其它所使用的化学试剂均为分析纯。

1.2 试验仪器

UV-1100型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；KQ-100TDE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 芦丁标准曲线的测定

配制成一定浓度芦丁标准溶液，后按文献方法［8］，利用紫外可见分光光度计测定溶液在510 nm处的吸光度，以吸光度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，绘制曲线拟合得回归方程y=9.930 7x-0.005 5，

1.3.2 鸡桑叶总黄酮的测定

用移液枪吸取一定量的提取液，按照1.2.1方法进行测试得吸光度，计算得总黄酮浓度，按下式换算为总黄酮提取率。

式中：b（mg/L）为总黄酮浓度；V（L）为提取液体积；m（g）为鸡桑叶的质量。

1.3.3 鸡桑叶总黄酮的提取工艺

用蒸馏水将采摘的新鲜鸡桑叶洗净，取出于阳光下晾干，后置于50℃鼓风干燥箱干燥，粉碎备用。称取1 g鸡桑叶于圆底烧瓶中，加入乙醇并装上冷凝管，后置于按照所考察的工艺参数设定的超声波清洗器上进行回流，提取结束后，将提取物进行过滤与浓缩后于容量瓶中定容，计算总黄酮的提取率。

1.3.4 单因素实验设计

单因素考察在固定其它工艺条件（其中乙醇浓度、液料比、超声温度和超声时间分别为70%、20mL/g、70℃和25 min）不变的情况下，分别考察乙醇浓度（60%、65%、70%、75%、80%、85%）、液料比（10、15、20、25、30、35 mL/g）、超声温度（40、50、60、70、80、90℃）和超声时间（10、15、20、25、30、35 min）对鸡桑叶总黄酮提取率的影响。

1.3.5 响应面实验设计

在对单因素实验结果进行分析后，进一步对所考察的四个因素进行Box-Behnken实验设计，各因素与编码水平见表1。

表1 Box-Behnken实验设计Tab.1 Experimental design of Box-Behnken

1.3.6 鸡桑叶总黄酮的抗氧化能力

按文献方法［9］对DPPH·和·OH的清除效果进行测定。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇浓度的影响

从图1中可知，在所考察的乙醇浓度范围内，当乙醇浓度达到70%时，鸡桑叶总黄酮提取率达到最大，这是因为乙醇浓度较低时，含水量高，溶剂极性大，无法溶出太多极性较小的黄酮类物质。但乙醇浓度太高时，溶剂极性过小，鸡桑叶颗粒中极性较小的脂溶性杂质也一并溶出，并参与总黄酮的溶出竞争［10］，降低了总黄酮的提取率。因此乙醇浓度选择为70%。

图1 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids

2.1.2 液料比的影响

从图2中可知，在所考察的液料比范围内，当液料比达到20 mL/g时，鸡桑叶总黄酮提取率达到最大，这是因为液料比较小时，溶剂无法完全浸润鸡桑叶颗粒，颗粒内的总黄酮溶出有限，但液料比过大时，会增加浓缩过程总黄酮的损失［11］，降低了总黄酮的提取率。因此液料比选择为20 mL/g。

图2 液料比对总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of liquid to material ratio on the extraction yield of total flavonoids

2.1.3 超声温度的影响

从图3中可知，在所考察的超声温度范围内，当超声温度达到70℃时，鸡桑叶总黄酮提取率达到最大，这是因为超声温度较小时，溶剂的分子热运动较小，溶剂与鸡桑叶颗粒内物质的接触与交换频率较低，溶出的总黄酮较少，但超声温度过高时，部分耐热性较差的黄酮类物质会氧化或降解［12］，降低了总黄酮的提取率。因此超声温度选择为70℃。

图3 超声温度对总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the extraction yield of total flavonoids

2.1.4 超声时间的影响

从图4中可知，在所考察的超声时间范围内，当超声时间达到25 min时，鸡桑叶总黄酮提取率达到最大，这是因为超声时间较短时，溶剂与鸡桑叶颗粒作用时间较短，内部的黄酮类物质还尚未完全溶出，但超声时间过长时，超声波长时间的空化与热作用导致了部分稳定性较差的黄酮类物质的降解［13］，降低了总黄酮的提取率。因此超声时间选择为25 min。

图4 超声时间对总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of total flavonoids

2.2 响应面实验

2.2.1 模型及方差分析

根据单因素实验的最佳条件，以总黄酮提取率为响应值（Y），结合Box-Behnken实验设计原理，确定以乙醇浓度（A）、液料比（B）、超声温度（C）和超声时间（D）4个因素为总黄酮提取率的影响因素，并设计响应面实验，结果及方差分析分别见表2-3。

表2 响应面实验及结果Tab.2 Response surface experiment and results

利用Design-Expert 8.05b软件对响应面设计的29个实验结果进行分析，得到鸡桑叶总黄酮提取率（Y）与所考察工艺的二次多项式回归模型为：

由Design-Expert 8.05b软件计算确定的回归模型方差分析表（表3）中可知P<0.000 1，表明该回归模型极显著；回归模型的决定系数R2=0.938 8，表明该回归模型具有较好的拟合度，有超过93.88%实验真实值可以利用该回归模型来描述；失拟度P=0.067 8>0.05，不显著，表明该提取工艺回归模型的预测值与实验真实值具有较好的拟合度，实验误差小；根据F值及P值可以得到所考察的工艺条件对鸡桑叶总黄酮提取率的影响顺序为：C超声温度>A乙醇浓度>D超声时间>B液料比。其中对鸡桑叶总黄酮影响极显著（P<0.01）的有乙醇浓度的一次项A、超声温度的一次项C，乙醇浓度的二次项A2、液料比的二次项B2、超声温度的二次项C2、超声时间的二次项D2；对鸡桑叶总黄酮影响不显著（P>0.05）的有液料比的一次项B、超声时间的一次项D，乙醇浓度和液料比的二次交互项AB、乙醇浓度和超声温度的二次交互项AC、乙醇浓度和超声时间的二次交互项AD、液料比和超声温度的二次交互项BC、液料比和超声时间的二次交互项BD、超声温度和超声时间的二次交互项CD，说明乙醇浓度、液料比、超声温度和超声时间之间的一次性、二次项及交互项与响应值之间不是简单的线性关系。综上分析，该回归模型具有较高的拟合度和较小的误差，准确率高，可以用于鸡桑叶总黄酮提取工艺的分析与预测。

表3 回归模型方差分析Tab.3 Analysis variance of regression model

2.2.2 响应面分析

响应面图的坡度和等高线的密集程度可以直观地分析所考察的乙醇浓度、液料比、超声温度和超声时间工艺间的交互作用对响应值的影响情况。通过对图5中响应面和等高线图的比较，可以看出乙醇浓度和超声温度的交互作用的响应面图坡度最为陡，等高线分布线最为密集，说明所考察的因素中对鸡桑叶总黄酮提取率的影响最为显著的是乙醇浓度和超声温度的交互作用，而超声温度和超声时间交互作用的响应面曲线坡度陡峭程度次之，等高线疏密程度也次之，说明所考察的因素中对鸡桑叶总黄酮提取率的影响程度次之的为超声温度和超声时间的交互作用，同理，可得所考察的乙醇浓度、液料比、超声温度和超声时间之间的交互作用对鸡桑叶总黄酮提取率的影响顺序为AC>CD>BD>AB>BC>AD。

图5 各工艺因素交互作用对总黄酮提取率的影响Fig.5 Interaction effect of various factors on the extraction yield of total flavonoids

2.2.3 最优验证

根据表2的响应面实验数据，并利用Design Ex‑pert 8.0.5b软件进行分析，确定鸡桑叶总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度72.81%，液料比20.86 mL/g，超声温度63.11℃和超声时间24.65 min，此时通过软件计算的鸡桑叶总黄酮提取率的预测值为37.73 mg/g，由于理论预测值的操作工艺设置较为繁琐，将工艺条件修正为乙醇浓度73%，液料比21 mL/g，超声温度63℃和超声时间25 min。根据修正后的工艺参数进行实验，并进行平均，得到鸡桑叶总黄酮的提取率为37.08 mg/g，其与理论值相对误差为1.72%，说明该二次回归模型拟合度好，误差小，可靠性强，适用于鸡桑叶总黄酮超声辅助提取工艺的优化。

2.3 鸡桑叶总黄酮的抗氧化活性

2.3.1 鸡桑叶总黄酮对DPPH·的清除效果

如图6所示，在所考察的浓度范围内，DPPH·清除能力随着维生素C和鸡桑叶总黄酮浓度的增加而增大，清除率与浓度存在量效关系，经计算得到维生素C和鸡桑叶总黄酮对DPPH·清除的IC50分别为49.57 mg/L和60.51 mg/L，说明鸡桑叶总黄酮具有清除DPPH·的能力，且对DPPH·的清除能力要强于李瑞雪等［14］研究的屏边鸡桑。

图6 维生素C和总黄酮对DPPH·的清除效果Fig.6 Scavenging effect of vitamin Cand total flavonoids on DPPH·

2.3.2 鸡桑叶总黄酮对·OH的清除作用

如图7所示，在所考察的浓度范围内，·OH清除能力均随着维生素C和鸡桑叶总黄酮浓度的增加而增大，清除率与浓度存在量效关系，经计算得到维生素C和鸡桑叶总黄酮对·OH清除的IC50分别为94.96 mg/L和156.05 mg/L，说明鸡桑叶总黄酮具有清除·OH的能力，且对·OH的清除能力要强于张月等［15］研究的桑叶，鸡桑叶总黄酮具有一定的抗氧化能力，是一种潜在的天然抗氧化剂。

图7 维生素C和总黄酮对·OH的清除效果Fig.7 Scavenging effect of vitamin Cand total flavonoids on·OH

3 结论

在单因素实验的基础上结合响应面实验设计得到鸡桑叶总黄酮的最佳提取工艺条件为乙醇浓度73%，液料比21 mL/g，超声温度63℃和超声时间25 min，得到鸡桑叶总黄酮的提取率为37.08 mg/g，其与理论值相对误差为1.72%，说明该二次回归模型拟合度好，误差小，可靠性强。考察了鸡桑叶总黄酮对DPPH·和·OH的清除效果，结果表明鸡桑叶总黄酮对DPPH·和·OH均有一定的清除效果，且清除效果与浓度存在量效关系，其对DPPH·和·OH的清除效果的IC50分别为60.51 mg/L和156.05 mg/L，说明鸡桑叶总黄酮具有一定的抗氧化能力，是一种潜在的天然抗氧化剂，为鸡桑叶资源的开发与利用提供了基础理论与参考。