热习服训练对劳力性热射病大鼠肝保护作用机制研究

郭俊峰， 王蓓蓓， 王 玲， 葛 凤， 柳云恩,3， 丛培芳,3 ， 金红旭， 高 燕北部战区总医院.急诊医学部；3.全军重症(战)创伤实验室，辽宁 沈阳 006；2.大连医科大学研究生院，辽宁 大连 6044

劳力性热射病(exertional heatstroke,EHS)作为一种严重的物理因素致病性疾病，发病率正伴随恶劣天气发生率增高而增高[1]。2003年欧洲高温天气导致法国死亡的15 000余人中，大部分死于经典型热射病(classic heatstroke,CHS)和EHS[2]。EHS起病急、进展快、致死和致残率高且好发于青壮年，受到临床重视[3]。EHS早期即可表现为多脏器功能衰竭综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)，其中，中枢神经系统、凝血系统、肝、横纹肌受累频率最高。

目前,EHS引起脏器损伤的机制尚无统一结论，主要有“类脓毒症”学说、热损伤学说、缺血再灌注学说等[4]。EHS患者存在广泛的内皮细胞损伤，而内皮细胞与Kupffer细胞是肝清除系统的重要组成成分[5]。动物实验发现，血管内皮细胞损伤造成的屏障功能缺失是导致热射病后继发感染的重要因素之一[6]。此外，在线粒体动力学相关研究中发现，线粒体的质量与功能的动态平衡对于细胞稳态尤为关键，线粒体可通过生物发生和自噬消除维持其质量与数量的动态平衡[7-8]。关于线粒体自噬的研究中，以针对PTEN诱导假定激酶1(PTEN-induced kinase 1，PINK1)/Parkin途径的研究较多，PINK1/Parkin途径已被证实与神经退行性疾病(如帕金森病)关系密切[9]。但有关PINK1/Parkin途径与EHS致肝损伤相关研究较少。此外，热习服训练(heat acclimation training，HAT)已被证实可降低EHS的发病率[10]。本研究将对HAT、PINK1/Parkin途径介导线粒体自噬与EHS致肝损伤的关系进行探究，旨在为EHS的防治提供新的观点及思路。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 65只清洁级成年雄性SD大鼠(8周龄，200～220 g)均购自辽宁长生生物有限公司，于昼夜交替12 h/12 h环境中适应性饲养7 d，期间自由进食饮水。

1.2 实验分组与模型建立 将65只SD大鼠分为对照组(Con组，n=6)、EHS组(n=44)、热习服组(HA组，n=15)。所有组均进行3 d适应性跑台训练，跑台速度由10 m/min梯次递增至15 m/min，测定跑台前后体质量、直肠温度(Tre)。HA组适应性跑台后休息2 d，再进行3次高温跑台训练，每次20 min。EHS组和HA组完成训练后进行高温跑台实验，记录跑台前体质量、Tre，跑台开始15、25、30 min时Tre，30 min后每5 min记录一次Tre，直至Tre≥42.0℃，记录大鼠体质量、Tre、翻正反射等特征。

1.3 主要试剂 通用二步法免疫组化检测试剂盒(小鼠/兔)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自大连美伦生物技术有限公司；阿利新兰-过碘酸-雪夫染色试剂盒、全蛋白提取试剂盒、SDS-PAGE凝胶试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；小鼠抗大鼠β-actin、PINK1；兔抗大鼠核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)-p65、细胞色素c(cytochrome c,Cyto-c)、CD31；山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔均购自英国Abcam公司；兔抗大鼠Parkin购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 苏木素-伊红染色观察不同时间点大鼠肝组织病理学变化 每次随机选取每组3只大鼠肝组织，使用10%中性福尔马林固定液固定48 h后，按梯度乙醇-二甲苯脱水、石蜡包埋、连续切片(3 μm)后，按照二甲苯、梯度乙醇脱蜡复水，进行苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色、脱水、中性树脂封片、显微镜观察。

1.4.2 AB-PAS染色观察不同时间点大鼠肝糖类代谢变化 取1.4.1部分获取的石蜡切片，按试剂盒说明进行AB-PAS染色、脱水、中性树脂封片、显微镜观察。

1.4.3 TUNEL染色观察不同时间点大鼠肝细胞凋亡水平 取1.4.1部分获取的石蜡切片，按照二甲苯-无水乙醇-90%乙醇-75%乙醇进行脱蜡复水后用20 μg/ml蛋白酶K进行细胞膜通透，然后按照1∶9比例配置TUNEL工作液对标本进行标记，37℃孵育60 min，PBS漂洗后滴加DAPI 50 μl/片染核，抗衰减封片剂封片后使用荧光显微镜于暗室中观察。

1.4.4 蛋白免疫印迹实验检测大鼠肝PINK1、Parkin、Cyto-c、NF-κB、CD31表达情况 每次随机选取每组3只大鼠肝组织100 mg，用全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，经BCA法进行总蛋白定量后稀释成1 mg/ml组织匀浆，加入5倍上样缓冲液，100℃沸水浴中 5 min进行蛋白变性。以10 μg/孔进行垂直SDS-PAGE凝胶电泳，4℃环境中湿法转移目标蛋白至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭(2 h)后，按比例加入兔抗大鼠Parkin、Cyto-c、NF-κB、CD31一抗、小鼠抗大鼠PINK1、β-actin一抗4℃孵育过夜，经PBST漂洗3次后加入稀释后山羊抗兔(小鼠)二抗(1∶5 000)孵育2 h，PBST再次漂洗3次后，加入ECL工作液进行显色后，进行荧光灰度分析。

1.4.5 免疫组织化学染色检测大鼠肝CD34表达情况 取1.4.1部分获取的石蜡切片，按照二甲苯-无水乙醇-90%乙醇-75%乙醇进行脱蜡复水，用pH=6的柠檬酸钠抗原修复液进行高温抗原修复，对内源性过氧化物酶进行灭活(10 min)，加入1 mg/ml BSA进行封闭，滴加目标一抗(75 μl/片)4 ℃孵育过夜，PBS漂洗后加入反应增强液反应20 min，再次PBS漂洗后滴加增强型鼠/兔二抗室温孵育20 min后添加DAB工作液显色(镜下观察到出现棕黄色颗粒时终止显色)，脱水、中性树脂封片，显微镜下观察。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况观察 Con组大鼠进食、饮水状态良好，翻正反射正常；EHS组和HA组发病时均出现拒食、拒水，翻正反射减弱甚至消失。

2.2 3组大鼠72 h存活率及EHS组、HA组大鼠发病时间、体高温持续时间比较 EHS组、HA组的存活率、发病时间及核心体温达40℃持续时间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 大鼠72 h存活率及发病时间、体高温持续时间比较

2.3 各组大鼠肝组织形态学及糖类物质代谢情况观察 HE染色结果显示，与Con组比较，EHS组和HA组2 h和6 h均可观察到肝细胞肿胀、胞浆淡染，并伴有肝血窦淤血，但HA组程度较EHS组程度轻。EHS组和HA组24 h均可观察核周空泡形成。与EHS组比较，HA组24 h时核周空泡更多，但炎症细胞浸润较轻，48 h后EHS组和HA组镜下可观察到肝细胞空泡变性几乎蔓延至全小叶。见图1～3。

图1 Con组肝组织形态(HE染色×20) 图2 EHS组肝组织形态(HE染色×20；a.发病后2 h；b.发病后6 h；c.发病后24 h；d.发病后48 h；e.发病后72 h) 图3 HA组肝组织形态学(HE染色×20；a.发病后2 h；b.发病后6 h；c.发病后24 h；d.发病后48 h；e.发病后72 h)

AB-PAS染色结果显示，EHS组各时间点均可观察到肝细胞内糖类物质被染成紫红色，2 h和72 h更为明显，HA组与EHS组相比，仅72 h时观察到胞内呈现明显紫红色。见图4～6。提示劳力性热射病发病后肝细胞糖类代谢可能受到抑制。

2.4 各组大鼠肝细胞凋亡及内皮细胞新生情况观察 TUNEL染色结果显示，EHS组和HA组6 h内肝细胞均出现明显凋亡，2 h内EHS组肝细胞凋亡率明显高于HA组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2，图7。免疫组化及蛋白质印迹法结果显示，EHS组和HA组大鼠在发生劳力性热射病后其肝表达CD34程度随时间进展均有增高，其中，发病后2 h和24 h HA组CD34表达量显著高于EHS组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

图4 Con组糖类代谢情况(AB-PAS染色×20) 图5 EHS组糖类代谢情况(AB-PAS染色×20；a.发病后2 h；b.发病后6 h；c.发病后24 h；d.发病后48 h；e.发病后72 h) 图6 HA组糖类代谢情况(AB-PAS染色×20；a.发病后2 h；b.发病后6 h；c.发病后24 h；d.发病后48 h；e.发病后72 h)

表2 两组大鼠不同时间点肝细胞凋亡率

图7 3组肝细胞凋亡情况(TUNEL染色×20；a.Con组；b.EHS组发病后2 h；c.HA组发病后2 h；d.EHS组发病后6 h；e.HA组发病后6 h)

表3 2组大鼠不同时间点肝CD34表达情况

2.5 各组大鼠肝PINK1/Parkin通路相关蛋白及凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax、NF-κB表达情况 根据蛋白质印迹法结果显示，与Con组相比，EHS组PINK1、Parkin表达量随时间呈下降趋势，24 h时出现上升，HA组PINK1表达在6 h时即出现上升趋势，但差异均无统计学意义(P>0.05)。HA组Parkin表达量自6 h开始至72 h均显著低于Con组，HA组自24 h开始Cyto-c表达量明显低于EHS组，差异有统计学意义(P<0.05)。与Con组相比，EHS组和HA组Bcl-2表达量均呈下降趋势。EHS 组24 h Bax表达量明显低于HA组和Con组，HA组72 h Bax表达量明显低于Con组，差异均有统计学意义(P<0.05)。HA组6 h至48 h NF-κB表达量显著低于Con组，差异均有统计学意义(P<0.05)。而CD31表达量虽有上升趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图8。

图8 各组不同时间点相关指标(a.PINK1；b.Parkin;c.Bcl-2;d.Bax;e.Cyto-c;f.NF-κB;g.CD31)

3 讨论

EHS的发生严重威胁人类健康，临床尚无特异性治疗，主要以脏器支持和并发症防治为主。因此，了解EHS致脏器损伤的病理生理学过程尤为重要。以往研究认为，EHS的致病机制主要包含全身广泛的内皮细胞损伤，而肝内皮系统较为发达，在EHS发病早期即可出现严重损伤，造成广泛的微血栓形成，使全身器官灌注不足加重、出血倾向增高[10]。此外，高热还可直接导致代谢相关酶系功能异常，使得线粒体能量生成减少，干扰损伤修复。内毒素等可诱导产生大量促炎性细胞因子，损伤内皮屏障，导致病理性凝血，甚至弥散性血管内凝血的发生[11-13]。此外，热处理可降低NF-κB通路的活化，并可以减少超氧化物的产生[14]。在EHS的预防与治疗相关指南中也认为HAT可显著降低EHS的发病率[10]。

本研究通过建立EHS大鼠动物模型，模拟EHS的致肝损伤过程后发现，高热可以直接影响线粒体有氧代谢过程，导致肝细胞、内皮细胞等糖类利用障碍，细胞能量生成不足，NF-κB通路活化，加剧肝细胞、内皮细胞凋亡过程。而PINK1/Parkin途径介导的线粒体自噬过程可通过改善受损的线粒体质控过程，加速受损线粒体清除过程，降低细胞内因线粒体受损的而产生的活性氧自由基等。此外，短时HAT虽不能改变EHS大鼠急性期病死率，但可以显著改善因高热导致的肝细胞能量代谢受损过程，降低NF-κB通路的活化。本研究在对EHS组和HA组大鼠肝进行免疫组织化学染色和蛋白免疫印迹检测后发现，HA组大鼠肝血管内皮细胞新生标志物CD34的表达量明显增加，提示HAT可以明显提高EHS大鼠肝血管内皮损伤修复速度，从而降低肝微血栓形成的风险。

有研究表明，HAT可降低因药物(如阿霉素、阿司匹林等)造成的肝损伤程度[15-17]；还可以通过激活肝细胞PINK1/Parkin途径介导的自噬过程，改善肝术后的缺血/再灌注损伤[18-19]。但也有文献报道HAT可通过抑制AKT/ERK途径，增强肿瘤血管生成能力[20-21]。在EHS性肝损伤过程中，HAT是否通过抑制AKT/ERK途径发挥保护作用仍需进一步研究证明。

综上所述，EHS导致的肝损伤严重影响生存率和预后，早期干预十分必要，本研究中发现HAT可显著降低EHS大鼠肝损伤程度，发挥保护作用。其机制可能是激活PINK1/Parkin途径介导的线粒体自噬过程，该发现可以为进一步特异性治疗EHS和药物研发提供潜在靶点。