大口黑鲈鱼皮胶原蛋白肽的制备及抗氧化活性研究

韩梦瑶 李新月 王晓梅 王国治 叶金云 张忠山

(1. 水生动物繁育与营养国家地方联合工程实验室，浙江 湖州 313000；2. 浙江省水生生物资源养护与开发技术研究重点实验室，浙江 湖州 313000；3. 中国水产科学研究院水生动物繁育与营养重点实验室，浙江 湖州 313000；4. 湖州师范学院生命科学学院，浙江 湖州 313000)

中国水域辽阔，水产资源丰富，其中淡水养殖占水产养殖产量的75%。鱼类在加工和消费过程中会产生约50%的下脚料，包含鱼皮、鱼尾、鱼骨、鱼鳍、鱼鳞等[1]，这些下脚料不仅会对环境造成污染，同时也是一种资源的浪费。大口黑鲈(Micropterussalmoides)俗称加州鲈，原产于北美洲，于20世纪80年代被引入中国养殖[2]，目前已成为中国养殖的主要淡水鱼种之一[3]。

胶原蛋白是结缔组织的重要组成部分，是一种白色、不透明、无支链的纤维状蛋白质，主要存在于动物的皮、骨、牙齿、韧带和血管中，起着支撑器官、保护机体的作用[4]，目前胶原蛋白的提取方法主要有酸法[5]、酶法[6]、碱法[7]、热水法[8]等。胶原蛋白肽是胶原蛋白的酶解产物，一般由3～20个氨基酸组成[9]，具有抗氧化、降血脂、提高免疫力等生物活性[10]。因其分子量小，溶解性好，易被人体肠道吸收，目前在保健食品、化妆品中得到广泛应用[11-12]。

人体内含有多种自由基，自由基会引起机体发生病变和衰老，甚至引起癌症。目前，研究人员[13-15]已从鳕鱼(Theragrachalcogramma)、鮟鱇鱼(Lophiuslitulon)、罗非鱼(Oreochromismossambicus)等鱼皮中得到了具有抗氧化活性的多肽，证实了从水产动物中提取的多肽具有良好的抗氧化活性，拥有较好的发展前景。大口黑鲈近年来在浙江省的养殖规模和产量增长非常迅速，深受养殖户和消费者的欢迎，但在深加工过程中会产生大量鱼皮副产物，其富含胶原蛋白，可作为提取胶原蛋白的原料。但目前对大口黑鲈鱼皮多肽的提取及其抗氧化活性报道较少。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

大口黑鲈鱼皮：湖州市海鲜市场；

30%双氧水、硫酸亚铁、硫酸铜、磷酸钠、钼酸铵、水杨酸、铁氰化钾、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、还原型辅酶Ⅰ(NADH)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

碱性蛋白酶(20万U/g)、中性蛋白酶(10万U/g)、木瓜蛋白酶(80万U/g)、胰蛋白酶(25万U/g)：上海源叶生物有限公司；

乙腈、三氟乙酸：色谱纯，美国Sigma公司。

试验用水为Milli-Q去离子水。

1.1.2 主要仪器设备

冷冻高速离心机：TG16KR型，长沙东旺实验仪器有限公司；

循环水式真空泵：SHZ-P(Ⅲ)型，杭州庚雨仪器有限公司；

紫外可见分光光度计：UV-1200 型，南京菲勒仪器有限公司；

质谱仪：AutoflexⅢ型，日本岛津仪器有限公司；

电泳仪：POWER 300型，莱普特仪器科学仪器公司；

冷冻干燥机：SJIA-10N型，宁波市双嘉仪器有限公司；

数显鼓风干燥箱：BGZX-9076MBE型，广州航信科学仪器有限公司；

电热恒温水浴锅：DK-S24型，无锡沃信仪器制造有限公司；

电子天平：AR224CN型，广州市怡华新电子仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 大口黑鲈鱼皮胶原蛋白的制备 鱼皮清洗后烘干，剪成0.5 cm×0.5 cm的小块，加入0.5 mol/L碳酸钠溶液搅拌浸泡24 h，脱去杂蛋白和色素，用蒸馏水冲洗至pH 7，晾干。按m鱼皮∶V10%异丙醇为1∶10 (g/mL)的比例混合搅拌浸泡24 h进行脱脂处理，蒸馏水洗净，晾干；将除杂后的鱼皮按照料液比(m鱼皮∶V乙酸) 1∶100 (g/mL)的比例加入含有0.3%胃蛋白酶的0.5 mol/L乙酸中搅拌浸泡24 h，4 000 r/min离心10 min，上清液缓慢加入氯化钠盐析24 h，4 000 r/min离心10 min，沉淀用乙酸复溶，蒸馏水透析，真空冷冻干燥得到大口黑鲈鱼皮胶原蛋白。

1.2.2 不同酶解胶原肽的制备 称取大口黑鲈鱼皮胶原蛋白1 g，按照料液比(m鱼皮胶原蛋白∶V乙酸)1∶100 (g/mL)的比例，加入0.5 mol/L 乙酸溶解，得到胶原蛋白溶液。分成4份，向其中加入碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶，并调节胶原蛋白溶液pH在各酶的最适pH范围内(表1)，最适温度下酶解4 h，100 ℃灭酶10 min，冷却至室温后离心(4 000 r/min，10 min)，取上清分别得到碱性蛋白酶酶解胶原蛋白肽(APP)、中性蛋白酶酶解胶原蛋白肽(NPP)、木瓜蛋白酶酶解胶原蛋白肽(PP)、胰蛋白酶酶解胶原蛋白肽(TP)。

表1 4种蛋白酶的最适pH、温度Table 1 Optimal pH and temperature for 4 kinds of proteases

1.2.3 胶原蛋白及胶原蛋白肽分子量测定

(1) 胶原蛋白SDS-PAGE凝胶电泳：根据文献[16]修改如下：称取5 mg胶原蛋白溶于1 mL 5% SDS溶液，85 ℃变性1 h，冷却至室温，5 000 r/min离心10 min，取上清液备用。配制8%的分离胶和4%的浓缩胶，加入20 μL 的蛋白样品和高分子量的蛋白质标记物，在电泳槽中加入电泳缓冲液，电泳结束后，加入考马斯亮蓝R-250染液染色4 h，回收染色液，加入乙酸—甲醇脱色液，数小时更换一次脱色液，直至背景清晰，放入凝胶成像仪进行观察。

(2) 大口黑鲈鱼皮胶原蛋白的紫外吸收光谱：根据文献[17]修改如下：将大口黑鲈鱼皮胶原蛋白用0.5 mol/L乙酸配制成质量浓度为1 mg/mL的溶液，用紫外分光光度计在波长范围400～200 nm扫描。

(3) 质谱仪测定胶原蛋白肽分子量：根据文献[18]修改如下：设定波长λ=337 nm，加速电压25 kV。乙腈和超纯水1∶1混合(含0.1%三氟乙酸)作为溶剂使用，将APP、NPP、PP、TP溶解于溶剂中，配成1 mg/mL的溶液。样品和基质溶液1∶1 (g/mL)混合，取1 μL点在靶板上，自然干燥后，将样品板放进仪器中进行测定。

1.2.4 水解度测定 采用茚三酮法[19]，按式(1)计算胶原蛋白肽的蛋白水解度(DH)。

(1)

式中：

d——水解度，%；

N1——蛋白酶水解后氨基态氮含量，μmol/L；

N2——原料中游离氨基态氮含量，μmol/L；

N0——原料中总游离氨基态氮含量，μmol/L。

1.2.5 胶原蛋白肽抗氧化活性研究

(1) 总抗氧化能力：采用钼酸铵法[20]，酶解胶原蛋白肽与钼酸铵溶液反应，于695 nm进行比色，吸光度代表各管总抗氧化能力。

(2) 还原能力：采用铁氰化钾还原法[21]，以pH 6.6磷酸盐缓冲液代替样品作为空白对照，测定各管OD值，绘制还原能力曲线。

(3) 清除DPPH·活性：根据文献[22]，按式(2)计算DPPH·清除率。

(2)

式中：

η——自由基清除率，%；

A0——对照管OD值；

A1——加入胶原蛋白肽的OD值。

(4) 清除·OH活性：采用水杨酸法[23]，以3 mmol/L 水杨酸溶液进行调零，于510 nm下测吸光度，按式(2)计算胶原蛋白肽对·OH的清除率。

(3)

式中：

A0——加入Tris-HCl缓冲液的OD值；

A1——加入胶原蛋白肽的OD值。

(6) 亚铁离子螯合能力：根据文献[25]，按式(4)计算胶原肽的亚铁离子螯合能力。

(4)

式中：

η——亚铁离子螯合率，%；

A0——对照管OD值；

A1——加入胶原蛋白肽的OD值。

(7) 脂质氧化抑制活性：根据文献[26]修改如下：将0.5 mL酶解胶原蛋白肽与2.5 mL 2.5%亚油酸无水乙醇、2 mL磷酸盐缓冲液混合，吸取0.0～0.1 mL混合液，用75%乙醇补足至5 mL，随后加入30%硫氰酸铵溶液0.1 mL，20 mmol/L FeCl20.05 mL，准确计时3 min，在500 nm处测定吸光度，并用蒸馏水代替FeCl2作为空白管调零，按式(5)计算胶原蛋白肽脂质氧化抑制率。

(5)

式中：

η——脂质氧化抑制率，%；

A0——对照管OD值；

A1——加入胶原蛋白肽的OD值。

1.2.6 数据分析 数据结果以平均值±标准偏差表示，采用Graphpad Prism 9对试验数据进行处理及作图。

2 结果与分析

2.1 胶原蛋白及胶原蛋白肽分子量

2.1.1 胶原蛋白SDS-PAGE凝胶电泳 由图1可知，大口黑鲈鱼皮胶原蛋白主要由两条120 kDa的α链和一条200 kDa的β链组成，符合Ⅰ型胶原蛋白的特征。Ⅰ型胶原蛋白是鱼皮和鱼鳞中发现的主要胶原蛋白，主要由两条α链和一条β链组成[16]。β链是α链的二聚体，表明Ⅰ型胶原蛋白结构完整，胃蛋白酶未破坏胶原蛋白的结构，与周瑞等[6]研究结果保持一致。图1中，在α2条带以下，无其他明显的条带，表明提取的大口黑鲈鱼皮胶原蛋白纯度较高，三螺旋结构保持完好。

图1 大口黑鲈鱼皮胶原蛋白SDS-PAGE图Figure 1 SDS-PAGE image of Micropterus salmoidesskin collagen

图2 大口黑鲈鱼皮胶原蛋白的紫外吸收光谱Figure 2 Ultraviolet absorption of collagen fromMicropterus salmoides skin

2.1.3 不同蛋白酶酶解胶原肽质谱图 由图3～图6可知，APP、NPP、PP、TP的相对分子质量分别集中在110～1 942，200～1 883，112～1 943，120～1 951 Da。不同的蛋白酶具有不同的酶切位点，从而使得APP、NPP、PP、TP氨基酸组成和序列发生变化，相对分子质量出现差异。研究[29]表明，分子量越小，抗氧化活性越高，更易被人体吸收。

图3 APP质谱图Figure 3 APP mass spectrum

图4 NPP质谱图Figure 4 NPP mass spectrum

图5 PP质谱图Figure 5 PP mass spectrum

图6 TP质谱图Figure 6 TP mass spectrum

2.1.4 不同蛋白酶酶解胶原肽氨基酸的相对百分含量

如表2所示，APP、NPP和PP都含有12种氨基酸，而TP仅含有11种氨基酸。氨基酸的种类、数量及排列顺序与多肽抗氧化能力有着紧密联系。研究[30]表明，酸性氨基酸(Asp、Glu)、芳香族氨基酸(Phe、Tyr、Trp)、含硫基氨基酸(Met、Cys)和疏水性氨基酸具有较强的抗氧化能力。试验中APP所含有的抗氧化氨基酸种类和含量较为丰富，因此推断APP具有较强的抗氧化能力。

表2 不同蛋白酶酶解胶原肽氨基酸的相对百分含量Table 2 The relative percentages of amino acids in collagen peptides hydrolyzed by different proteases %

2.2 酶种类对胶原蛋白水解度的影响

蛋白质通过酶解，生成的小分子肽更易被人体吸收。通过测定其水解度，可以了解不同蛋白酶的酶解程度。由图7可知，碱性蛋白酶的酶解效果最好(P<0.05)，其水解度可以达到25.44%，其他3种蛋白酶的酶解效果相差不大，与胡杨等[31]研究结果一致。结合质谱图可知，水解度越大，肽键断裂更彻底，分子量越小。

图7 不同蛋白酶的水解效果比较Figure 7 Comparison of hydrolysis effects of different proteases

2.3 大口黑鲈鱼皮胶原蛋白肽的抗氧化活性

2.3.1 总抗氧化能力 由图8可知，4种蛋白酶酶解胶原蛋白肽都具有总抗氧化能力，并且随浓度的增加呈上升趋势，其中APP总抗氧化能力明显优于其他3种蛋白酶酶解胶原蛋白肽。这可能与其水解度有关，碱性蛋白酶水解度最高，肽键断裂更彻底，更有利用水解出抗氧化氨基酸，提高胶原蛋白肽的抗氧化活性[32]。

2.3.2 还原能力 由图9可知，4种蛋白酶酶解胶原肽都具有还原能力，但APP还原能力明显优于其他3种蛋白酶酶解胶原蛋白肽(P<0.05)，当APP质量浓度为10 mg/mL 时，吸光度达到0.958，优于鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽[27](还原能力为0.676)。总抗氧化能力和还原能力之间具有明显的正相关性，由图8和图9可知，抗氧化和还原能力依次为APP>NPP>PP>TP。结果表明，大口黑鲈鱼皮胶原蛋白肽的抗氧化活性与其浓度和酶解液的水解度密切相关。

图8 不同酶解胶原蛋白肽总抗氧化能力Figure 8 Total antioxidant capacity of collagen peptides hydrolyzed by different enzymes

图9 不同酶解胶原蛋白肽还原能力Figure 9 Different enzyme hydrolyzed collagen peptide reduction ability

2.3.3 清除DPPH·活性 由图10可知，质量浓度为0.25～2.00 mg/mL时，TP清除DPPH·能力并未随着其质量浓度的升高而增强，当质量浓度达到2.50 mg/mL时，清除率明显上升，原因可能是设定浓度还未达到其合适浓度。而其他3种蛋白酶酶解胶原蛋白肽清除率远远高于TP，当APP质量浓度为1.5 mg/mL时，DPPH·清除率已达到最大值56.35%。可以看出，在相同浓度下，APP具有较强的DPPH·清除率。原因可能是碱性蛋白酶是一种深入的内切蛋白酶，能够切除多种肽键，释放出活性肽段，更有利于清除自由基，提高抗氧化能力。

图10 不同酶解胶原蛋白肽DPPH·清除率Figure 10 DPPH free radical scavenging rate of different enzymatically hydrolyzed collagen peptides

2.3.4 清除·OH活性 由图11可知，质量浓度为1～5 mg/mL 时，PP的·OH清除率无显著变化，仅为3.5%，其他3种蛋白酶酶解胶原蛋白肽清除率已达到55%～67%，原因可能是未达到PP的合适浓度。APP质量浓度在2～4 mg/mL时，清除率从31.55%升高到67.05%，显著高于PP(P<0.05)；在质量浓度为4 mg/mL 后，清除率呈平缓的趋势，表示已达到最大清除率。与大菱鲆鱼皮胶原蛋白肽[11]相比，APP对·OH的清除能力更强。

图11 不同酶解胶原蛋白肽·OH清除率Figure 11 Hydroxyl radical scavenging rate of different enzymatic collagen peptides

图12 不同酶解胶原蛋白肽清除率Figure 12 Scavenging rate of superoxide anion free radicals of different enzymatic collagen peptides

2.3.6 亚铁离子螯合能力 由图13可知，在胶原蛋白肽质量浓度为0.125～0.250 mg/mL时，APP亚铁离子螯合能力增加趋势最为明显。从清除率趋势来看，APP亚铁离子螯合能力最强，与杨雅兰等[33]研究结果一致。可能与碱性蛋白酶水解度最高有关，碱性蛋白酶具有最强的剪切力，通过水解使其释放出更多的活性肽段和氨基酸，从而与亚铁离子进行螯合。

图13 不同酶解胶原蛋白肽亚铁离子螯合能力Figure 13 Different enzyme-hydrolyzed collagen peptides with ferrous ion chelating ability

2.3.7 脂质氧化抑制活性 由图14可知，4种蛋白酶酶解胶原蛋白肽对脂质氧化都具有很高的抑制活性，抑制率可以达到99%。脂质氧化生成的醛与糖尿病、阿尔兹海默症等疾病密切相关[34]，而胶原蛋白肽可以有效抑制脂质氧化，预防疾病的发生。

图14 不同酶解胶原蛋白肽脂质氧化抑制活性Figure 14 Different enzyme hydrolyzed collagen peptides lipid oxidation inhibitory activity

3 结论

通过SDS-PAGE凝胶电泳证实了从大口黑鲈鱼皮中提取的胶原蛋白为Ⅰ型胶原蛋白，含有3条链，分别为两条120 kDa的α链和一条200 kDa的β链。采用酸酶复合法提取大口黑鲈鱼皮胶原蛋白不仅可以提高效率和得率，而且可以保持胶原蛋白的三螺旋结构。试验利用4种蛋白酶酶解大口黑鲈鱼皮胶原蛋白，结果表明，4种蛋白酶酶解胶原蛋白肽均具有抗氧化能力，且抗氧化能力和胶原蛋白肽浓度、水解度都呈一定的正相关关系。水解度越大，分子量越小，抗氧化活性越高。蛋白酶的种类对胶原蛋白肽具有一定的影响，有可能是不同酶类具有不同的酶切位点，酶解成不同分子量和氨基酸组成的胶原蛋白肽，从而产生不同的抗氧化活性。4种蛋白酶中，碱性蛋白酶具有最高的水解度和抗氧化活性。