不同品种菊花涩味成分及其与唾液的相互作用

田 星 叶慧洁 刘石峰 欧阳瑶力

(1. 湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208；2. 湖南省康德佳林业科技有限责任公司，湖南 永州 425600)

菊花为菊科菊属宿根性草本植物，除观赏外，还有药用及食用价值[1]。菊花含有丰富的多酚类、黄酮类、三萜类、挥发油类和有机酸类等，具有抗氧化、抑菌、抗肿瘤以及抗炎等药理作用[2]。而作为独特的花茶保健饮品，大部分菊花都是以茶饮的形式被消费，但是菊花茶有涩味，而无法满足消费者的口腔愉悦感，导致单纯的菊花茶产品市场认可度偏低。一些生产商为了减弱、掩盖其涩味，在菊花茶饮中加入白砂糖等甜味剂矫味，这也一定程度上影响了消费者的感官体验感。

多酚类物质是食品中主要的呈涩物质[3]，此外，金属盐类的多价阳离子、具有高等电点的碱性蛋白以及壳聚糖等物质也能产生涩味[4]。呈涩物质与唾液蛋白相互作用导致蛋白沉淀，口腔中的润滑感减少而产生涩感。近年来，不少学者对于涩感产生的潜在机制提出了不同的假设，如唾液膜破裂、唾液润滑减少、受体(机械和化学受体)感受到的机械感知和组织的收缩[5]。Chen等[6]认为口腔被一层唾液膜覆盖、润滑，口腔加工某些食物和饮料会使其受损。唾液膜分为两层，一层是动态的、容易移除的；另一层是与上皮细胞共价连接的。唾液膜的破坏会使细胞表面和受体暴露，导致表面疏水性增高，摩擦增加，产生涩味[7-8]。Gibbins等[9]研究认为呈涩化合物与唾液作用会引起口腔表面性质、流变性和润滑性的改变。目前，涩味感知的研究方法主要包括感官评价等直接检验、SDS-PAGE凝胶电泳试验等唾液复合物的间接检验、生物摩擦学评估以及分子动力学模拟等[10]。而评价菊花茶涩味特征评价主要采用感官评定的方法，这种方法更适合对菊花茶整体滋味特征评价，但不能量化评价每一种滋味的呈味强度。

研究拟以不同品种的菊花(皇菊、金丝皇菊、杭白菊、亳菊、贡菊)为研究对象，分析其水提物中总多酚、总黄酮、绿原酸含量，通过电子舌智能味觉分析系统及传统感官评定确定其主要涩味成分，并利用SDS-PAGE凝胶电泳法等探究呈涩物质与唾液的相互作用，以期为菊花茶的脱涩，提高消费者的感官体验提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金丝皇菊、皇菊：湖南省康德佳林业科技有限责任公司；

杭白菊：杭州巨佳茶叶有限公司；

亳菊、贡菊：安徽常富国药有限公司；

SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒：碧云天生物技术有限公司；

总蛋白测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；

Bradford蛋白浓度测定试剂盒：福州飞净(Phygene)生物科技有限公司；

没食子酸标准品：上海麦克林生化科技有限公司；

芦丁标准品、绿原酸标准品：江西佰草源生物科技有限公司；

α-淀粉酶：5万U/g，上海瑞永生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

电泳仪：JY300C型，北京君意东方电泳设备有限公司；

高效液相色谱仪：1260 Infinity II型，安捷伦科技有限公司；

紫外可见分光光度计：UV-1780型，岛津仪器(苏州)有限公司；

荧光分光光度计：F16Pro型，上海棱光技术有限公司；

旋转蒸发器：RE-52C型，巩义市中天仪器科技有限公司；

酶标仪：FC型，美国赛默飞世尔科技公司；

pH计：STARTER3100型，奥豪斯仪器(上海)有限公司；

电导率仪：STARTER 3100C/F型，奥豪斯仪器(上海)有限公司；

凝胶成像分析系统：Universal HoodⅡ型，美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 不同品种菊花水提物的制备 取适量皇菊、金丝皇菊、杭白菊、亳菊、贡菊，用粉碎机研磨成粉末，准确称取菊花各(3.00±0.01) g于250 mL圆底烧瓶中，按m菊花粉∶V水=1∶40 (g/mL)加入蒸馏水，于90 ℃的恒温水浴锅中提取40 min，所得浸提液在5 000 r/min条件下离心5 min，并在65 ℃条件下减压浓缩1 h，溶液冷冻干燥，所得提取物粉末于-20 ℃保存备用。

1.3.2 总多酚含量测定

(1) 标准曲线绘制：准确称取0.005 g没食子酸标准品，加少量蒸馏水溶解，定容至100 mL，分别吸取0，1，2，3，4，5 mL于试管中，加入蒸馏水至总体积为5 mL，混匀，加入福林酚试剂1 mL，静置1 min，加入10% Na2CO3溶液8 mL，用蒸馏水补足至25 mL，暗反应2 h，准确吸取5 mL，用蒸馏水稀释成10 mL，以试剂空白为对照，在760 nm处测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制总多酚含量标准曲线，得回归方程[11-12]。

(2) 样本测定：准确称取0.01 g的菊花样本水提物粉末，加蒸馏水溶解并定容至10 mL，分别取1 mL于试管中，按照标准曲线的方法测定吸光度。

1.3.3 总黄酮含量测定

(1) 标准曲线的绘制：精密称取芦丁对照品5 mg于25 mL容量瓶中，加少许70%乙醇，超声溶解，静置冷却至室温，用70%乙醇定容，精密量取对照品溶液l，2，3，4，5，6 mL，分别置于25 mL容量瓶中，加70%乙醇至总体积为6 mL，加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min，加入1 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6 min，加入10 mL 10%氢氧化钠溶液，再加70%乙醇至刻度，摇匀，静置15 min，以试剂空白为对照，于510 nm下进行检测。以对照品浓度C为纵坐标，吸光度A为横坐标，绘制总黄酮含量标准曲线，得回归方程[13]。

(2) 样本测定：准确称取0.01 g的样本提取物，加少量70%乙醇，超声处理使其溶解并用70%的乙醇定容至10 mL，按照标准曲线的方法测定吸光度。

1.3.4 菊花涩味特征分析

(1) 味觉特征值：准确称取样本2.00 g，加入150 mL沸水冲泡30 min，冲泡好的茶汤经双层纱布过滤，待其冷却至室温即得待测样品，用电子舌测定其涩味和涩味后感。

(2) 涩味感官评价：参照GB/T 16291.1—2012《感官分析 选拔、培训与管理评价员一般导则 第1部分：优先评价员》中所述方法，通过差别检验(两点法筛选)，筛选出10名感官评价员(3名男生，7名女生)组成感官评定小组。称取不同品种菊花各(2.00±0.01) g，加入150 mL沸水冲泡30 min，冲泡好的茶汤经双层纱布过滤，即得待测样品。感官评价员对每个样本的涩味指标采用五分制评分标准进行感官评分。参与感官前，评价员不得吃任何除水以外的食物，每名感官评价员单独进行评分，评定过程中相互之间不接触交流，各样品之间用清水漱口。

1.3.5 唾液与茶汤相互作用

(1) 唾液收集：称取不同品种菊花各(3.00±0.01) g，加入150 mL沸水，冲泡30 min，经感官评定筛选出的10名受试者分别饮用5个样品菊花茶(50 mL)，并在咽下后收集受试者的唾液。品尝完一个样品需用清水漱口，休息约2 min后开始品尝下一个样品(饮用了皇菊后收集的唾液样品标记为S1，饮用了金丝皇菊后收集的唾液标记为S2，饮用了杭白菊后收集的唾液标记为S3，饮用了亳菊后收集的唾液标记为S4，饮用了贡菊后收集的唾液标记为S5)。饮用菊花茶样品前先用清水漱口，并收集各受试者未饮用菊花茶前的唾液作为空白对照(标记为S0)。将收集的各受试者的唾液样本混合均匀，10 000 r/min离心10 min，取上清液备用。

(2) pH值测定：参照GB/T 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》中的玻璃电极法。

(3) 电导率测定：将唾液样本在4 000 r/min条件下离心20 min，收集上清液后用电导率仪测定。

(4) 总蛋白测定：采用总蛋白测定试剂盒(BCA法)测定。

(5) SDS-PAGE凝胶电泳分析：上层胶配方为2.92 mL ddH2O、1.37 mL 4×上层胶缓冲液、0.74 mL 30% Acr-Bis、50 μL 10% 过硫酸铵、5 μL TEMED；下层胶配方为3.4 mL ddH2O、2.5 mL 4×下层胶缓冲液、4.0 mL 30% Acr-Bis、100 μL 10%过硫酸铵、4 μL TEMED。取10 μL唾液样本和10 μL的2×上样缓冲液混合均匀，取10 μL混合液上样，进行电泳分析。电压为150 V。

(6) 唾液淀粉酶沉淀指数测定：参照文献[14]。

1.3.6 数据分析 每个样本进行3次重复试验，并采用SPSS 25.0软件(美国IBM公司)进行方差分析，P<0.05表示存在显著性差异，反之则表示差异不显著；采用Excel 2016(美国微软公司)进行绘图。

2 结果与分析

2.1 菊花主要呈涩味化学成分含量

由表1可知，5种不同品种的菊花中总黄酮含量由高到低依次为：皇菊、亳菊、金丝皇菊、杭白菊、贡菊。除贡菊和杭白菊之外，不同菊花之间总黄酮含量有着显著性的差异(P<0.05)。总体上来说，皇菊和亳菊的总黄酮含量明显高于其他3种菊花，且皇菊明显高于亳菊。5种菊花中总多酚含量由高到低为亳菊>皇菊>金丝皇菊>贡菊>杭白菊。不同菊花之间总多酚含量存在显著性差异(P<0.05)，但皇菊、亳菊和金丝皇菊的含量明显高于其他两种菊花，且亳菊与皇菊的总多酚含量无显著差异。5种菊花中绿原酸含量由高到低依次为：亳菊、皇菊、贡菊、金丝皇菊和杭白菊。除杭白菊和金丝皇菊外，不同菊花之间绿原酸含量有显著性差异(P<0.05)，且亳菊和皇菊的含量明显高于其他3种菊花。综上，5种菊花中，皇菊和亳菊中呈涩味的主要化学成分含量明显高于其他3种菊花，而杭白菊中呈涩味的主要化学成分的含量最低。

表1 5种菊花主要呈涩味化学成分含量†Table 1 The main astringent constituents of the five Chrysanthemum mg/g

2.2 菊花涩味特征分析

2.2.1 味觉特征值 由图1可知，涩味由强到弱为亳菊>皇菊>贡菊>杭白菊>金丝皇菊。涩味后味由强到弱为皇菊>亳菊>金丝皇菊>贡菊>杭白菊。涩味与涩味后味的强度略有不同，但总体上皇菊和亳菊较涩，且两者之间无显著性差异(P>0.05)。该结果与成分测定结果基本一致，说明多酚类化合物是造成菊花茶具有涩味的主要物质之一。

小写字母不同表示同一指标组间差异显著(P<0.05)图1 5种菊花的涩味特征值Figure 1 Determination of astringency characteristic values of five species of Chrysanthemum by electronic tongue technique

2.2.2 涩味感官评价 由图2可知，5种菊花的涩味由强到弱为皇菊>亳菊>金丝皇菊>杭白菊>贡菊。黄酮类、多酚类物质呈涩味，因此，菊花茶汤中黄酮类、多酚类物质越多，菊花茶的涩味越强。该结果与电子舌的涩味程度测定结果有一定差异，但与涩味后味的测定结果基本一致。研究[15-16]表明，涩感的完全建立通常需要15～20 s，而感官评定的时长远大于该时间，因此，该结果综合了菊花茶汤刚入口时的涩味强度与在评定过程中的涩味强度，且偏向涩味感知最强时的强度。

小写字母不同表示组间差异显著(P<0.05)图2 5种菊花的涩味感官评分Figure 2 Traditional sensory evaluation results of five different varieties of Chrysanthemum

皇菊的涩味明显强于亳菊，可能是因为感官评定时温度等条件的不同，电子舌测定时，所有的茶汤都是在室温条件下测量的，但是传统感官评定时，随着试验的进行，茶汤的温度逐渐降低，而较高的温度下，呈涩物质与唾液蛋白的结合更牢固、更持久[17]，有更强的涩感。也可能是因为电子舌技术是通过检测不同风味物质与人工质膜之间的静电或疏水相互作用引起的膜电位的变化而检测出不同的味觉强度，而人体是一个复杂环境，味觉的产生也受多种因素的影响，且味蕾作为味觉的终端感受器，它们之间存在交叉反应性[18]，菊花茶汤中的其他物质可能会增强或减弱对涩味的感知。

2.3 唾液与菊花茶汤相互作用

2.3.1 茶汤总蛋白含量 由表2可知，5种菊花茶汤之间的总蛋白含量差异较大，且皇菊>亳菊>金丝皇菊>贡菊>杭白菊。菊花中含有丰富氨基酸[19]，所以菊花茶汤中的总蛋白含量较高。而事实上，菊花茶中某些氨基酸呈涩味，5种菊花中皇菊和亳菊的总蛋白含量较高，这可能也是其涩味较强的原因之一。

表2 5种菊花茶汤总蛋白含量†Table 2 Total protein content of five varieties ofChrysanthemum tea

2.3.2 混合唾液基本指标 由表3可知，与原唾液相比，饮用完皇菊和杭白菊茶汤后的唾液电导率有一定程度的上升，而饮用完其他3种菊花茶汤后的唾液电导率有轻微的下降。饮用完皇菊、杭白菊、亳菊后唾液pH值较原唾液高，而饮用完金丝皇菊和贡菊茶汤后唾液pH值较原唾液低，但是变化的幅度都很小，说明唾液的电导率和pH值对其涩味的影响不大。而饮用完5种不同菊花茶汤后的唾液总蛋白含量差异不大，且都高于原唾液中的总蛋白含量，可能是茶汤中有一部分氨基酸残留在了口腔中，也有可能因为茶汤中的呈涩物质与唾液中的蛋白质沉淀后，口腔中的环境被破坏，为了恢复口腔环境，人体会分泌更多的唾液来润滑口腔，使其回到饮茶前的状态，因此饮茶后口腔中的总蛋白含量增加。

表3 饮用5种菊花茶后受试者混合唾液基本指标分析†Table 3 Analysis of basic indices of mixed saliva of subjects after drinking five different varieties of Chrysanthemum tea

2.3.3 SDS-PAGE凝胶电泳 由于饮用5种菊花茶汤后唾液中的蛋白含量无明显差异，而5种菊花的涩味有明显差异性，且皇菊和亳菊的涩味突出，为了进一步研究唾液与菊花茶汤的相互作用，对收集到的唾液进行了SDS-PAGE凝胶电泳试验。如图3所示，饮用皇菊茶后收集的唾液所对应的条带(S1)颜色最深，饮用杭白菊茶后收集到的唾液所对应的条带(S3)颜色最浅，且与原唾液所对应的条带(S0)相近，其他的则介于两者之间。条带颜色最深说明样品中蛋白含量最多，因此，结果表明饮用皇菊茶后收集的唾液样本中蛋白含量较多，饮用杭白菊茶后收集的唾液中蛋白含量最少，其他3种菊花则介于它们之间。

图3 饮用5种菊花茶后受试者混合唾液的SDS-PAGE电泳图Figure 3 SDS-PAGE images of interaction between five different varieties of Chrysanthemum and saliva

2.3.4 唾液淀粉酶沉淀指数 由图4可知，5种菊花涩味程度由强到弱为皇菊>亳菊>贡菊>金丝皇菊>杭白菊。该结果与电子舌和感官评定并不完全一致，可能是因为SAPI值的大小与涩味强弱有一定的相关性，但是并不完全正相关，也可能是因为菊花茶的涩味不仅仅完全是呈涩物质与唾液蛋白沉淀产生，还存在其他呈涩机制以及受其他因素的影响。

小写字母不同表示组间差异显著(P<0.05)图4 5种不同菊花的SAPI值Figure 4 SAPI values of five different varieties of Chrysanthemum

3 结论

多酚和黄酮类化合物的含量与菊花茶汤的涩味强度呈较强的正相关。5种菊花中多酚和黄酮类化合物含量最多的为皇菊和亳菊，相应地涩味最强的两种菊花也是皇菊和亳菊。菊花茶茶汤中呈涩物质与唾液中的蛋白反应对唾液的成分及其含量有明显影响，是引起收敛性、产生涩感的主要原因之一，同时口腔环境平衡被破坏。由于饮用茶汤后受试者的口腔环境重新迫切需要回到平衡状态，故导致在饮用茶汤后受试者的唾液分泌量和流速均明显增加。但由于引起涩味感知的物质众多且菊花本身成分复杂，呈涩物质与唾液蛋白沉淀不是产生涩味的唯一机制，还需进行更深入的研究。