染色体结构维持蛋白4在胰腺癌中表达的临床与生物信息学分析

孙炜玮，马丹丹，董庆泰，李中虎，林振宇，金炜东，杨瑞

（中国人民解放军中部战区总医院 普通外科，湖北 武汉 430070）

目前，胰腺癌的发病率和病死率在世界范围内逐年上升，这意味着胰腺癌将构成重大的公共卫生负担[1]。由于胰腺癌早期缺乏典型的临床表现，而肿瘤的快速发展又使得临床上诊断为胰腺癌的患者多为中晚期，失去了治疗的最佳时机，所以胰腺癌的5年生存率很低[2]。因此胰腺癌的诊断和治疗形势是严峻的。为了改善胰腺癌的临床疗效，研究人员试图根据肿瘤生物学和遗传学来制定新的治疗方案[3]。因此，探索具有高敏感性和特异性的胰腺癌预后生物标志物已成为近年来的研究热点。

染色体结构维持蛋白4（structural maintenance of chromosome 4，SMC4）参与维持染色体结构的稳定性和真核细胞的有丝分裂[4]。既往研究表明，SMC4在乳腺癌[5]、肝癌[6]、结肠癌[7]、神经胶质瘤[8]、肺 癌[9]、宫颈癌[10]等多种恶性肿瘤进展中发挥重要功能。但目前国内外关于SMC4 在胰腺癌中功能、预后评估、信号通路的报道甚少，机制不明。因此，本研究基于数据库数据明确SMC4 在胰腺癌中的mRNA表达情况，同时利用胰腺癌标本进一步验证SMC4 在胰腺癌中的蛋白表达情况。继而利用生物信息学技术分析其表达差异与临床病理特征及预后的关系，并探讨其可能参与的信号通路。为研究胰腺癌的早期诊断、病情监测及预后判断提供新思路。

1 资料和方法

1.1 SMC4在胰腺癌中表达的临床分析

1.1.1 SMC4在胰腺癌组中的蛋白表达分析：对2020年7月至2021年6月在中国人民解放军中部战区总医院接受根治性胰十二指肠切除术治疗的12例胰腺癌患者的组织标本进行分析。采用蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测SMC4在胰腺癌组织及配对癌旁组织中的表达。按照总蛋白抽提试剂盒操作说明提取蛋白。二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白浓度。配置分离胶和浓缩胶，取等量蛋白样本进行电泳分离。停止电泳，将全部蛋白电转移至聚偏氟乙烯膜，分别加入用封闭液稀释的SMC4及β-actin单克隆抗体（1∶1 000稀释），4 ℃孵育过夜，用TBST缓冲液（tris buffered saline tween）洗膜3次，每次10 min。再用封闭液稀释二抗（1∶5 000），室温摇床孵育1h，TBST洗膜3次，每次10 min。化学发光试剂曝光检测。蛋白条带的灰度值通过灰度扫描仪分析获得。

1.1.2 SMC4 在胰腺癌组织中的基因表达分析：在GEPIA（Gene Expression profiling interactive analysis）（http://gepia.cancer-pku.cn/）数据库中设定条件为：“gene:SMC4”“expression diy:boxplot”“cancer type：

PAAD”，获得SMC4 在胰腺癌组织与正常组织中的表达差异。纳入数据资料为TCGA数据库及GTEx数据库，其中胰腺癌组织179例，均来自TCGA数据库，正常胰腺组织171 例，其中4 例来自TCGA数据库，167例来自GTEx数据库。

1.1.3 SMC4 在胰腺癌组织中的mRNA表达分析：在TCGA下载的177例胰腺癌患者资料中，同时具有SMC4表达量数据及对应临床病理资料的患者共173例。以胰腺癌患者SMC4 mRNA表达量的中位数为分割点将患者划分SMC4 高表达组与SMC4 低表达组。采用Wilcoxon检验分析SMC4在胰腺癌组织中的mRNA表达差异。

1.2 生物信息学分析

1.2.1 SMC4相互作用蛋白网络：STRING（https://string-db.org/）数据库可根据文献报道、数据库收录数据及分子间共表达蛋白相关性等证据给出蛋白质间存在相互作用的可信度评分（score）。该分数越接近1，分子间存在相互作用的可信度越大，分数越接近0说明目前证据不足，可信度越低。在STRING中搜索蛋白质名称“SMC4”，选择物种“Homo sapiens”，可获取SMC4相互作用蛋白。

1.2.2 GSEA富集分析：GSEA（Gene set enrichment analysis）是基于JAVA语言的一款基因富集分析软件，本研究利用GESA软件进行KEGG通路富集分析。TCGA数据库中55 268 个基因被纳入分析。每次分析进行1 000次基因组排列。本次研究采用的基因集数据库为“c2.cp.kegg.v7.2 symbols.gmt”。校正P值及错误发现率（FDR）均＜0.05的基因组被认为具有显著性。

1.3 统计学分析

采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析。SMC4在胰腺癌中的蛋白表达差异采用配对样本t检验，SMC4 基因表达水平与胰腺癌患者临床病理特征的关系采用χ2检验。采用Kaplan-Meier法绘制患者生存曲线。胰腺癌患者临床病理特征和预后的关系采用单因素及多因素Cox回归分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SMC4在胰腺癌组织和癌旁组织中的蛋白表达差异

Western blotting检测结果显示SMC4在胰腺癌组织中的蛋白表达量高于癌旁组织[（1.658±0.043）vs（0.539±0.023）]，差异有统计学意义（t=79.541，P＜0.001）。见图

图1 SMC4在胰腺组织中的蛋白表达情况

2.2 SMC4 mRNA在胰腺癌组织和正常胰腺组织中的表达差异

对GEPIA数据库中，179例胰腺癌组织与171例正常胰腺组织对比分析显示，SMC4 mRNA在胰腺癌组织中的表达量显著增高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见图2。

图2 SMC4在胰腺组织中的mRNA表达情况

2.3 SMC4基因表达水平与胰腺癌患者临床病理特

征的关系

对TCGA数据库的173例SMC4基因表达水平与胰腺癌患者的病理分级（χ2=10.005，P=0.019）和T分期（χ2=10.395，P=0.015）密切相关，与年龄、性别、病理分期、N分期、M分期无关（均P＞0.05）。见表1。

表1 TCGA数据库中SMC4基因表达水平与胰腺癌患者临床病理特征的关系（例）

2.4 胰腺癌临床病理特征与预后的关系

单因素Cox分析结果显示SMC4 mRNA表达水平（HR1.650，95%CI1.085～2.511，P=0.019）和N分期（HR2.001，95%CI1.193～3.354，P=0.009）对胰腺癌患者的预后存在显著影响。进一步多因素Cox分析结果显示SMC4 mRNA表达水平（HR1.549，95%CI1.005～2.389，P=0.047）和N分期（HR1.829，95%CI1.045～3.201，P=0.035）是胰腺癌患者预后的独立危险因素。SMC4 mRNA表达水平越高提示胰腺癌不良预后的可能性更大。见表2。

表2 Cox回归分析TCGA数据库中胰腺癌临床病理特征与预后的关系

TCGA数据库中，根据SMC4 mRNA表达水平的中位数将胰腺癌患者分为SMC4高表达组与SMC4低表达组。利用Kaplan-Meier法绘制患者生存曲线。结果表明SMC4 高表达组胰腺癌患者的中位生存时间显著短于SMC4低表达组患者（19.73个月vs22.03个月，χ2=5.596，P=0.018），见图3。

图3 SMC4高表达组与SMC4低表达组胰腺癌患者的生存曲线

2.5 SMC4相互作用蛋白网络

利用STRING数据库分析人源SMC4 可能存在的蛋白相互作用网络图，结果表明：与SMC4相互作用Score排名前10 位的蛋白分别为NCAPH（Score=0.999）、NCAPG（Score=0.999）、SMC2（Score=0.999）、NCAPD2（Score=0.999）、NCAPD3（Score=0.999）、NCAPG2（Score=0.998）、NCAPH2（Score=0.997）、CDK1（Score=0.996）、PLK1（Score=0.991）、AURKB（Score=0.991）。见图4。

图4 SMC4相互作用蛋白网络

2.6 SMC4功能GSEA富集分析

GSEA研究结果显示：SMC4 mRNA高表达样本富集到ERBB信号通路、Wnt信号通路、TGF-β信号通路、Notch信号通路、VEGF信号通路、JAK STAT信号通路等相关基因集，详见表3。且SMC4 mRNA表达水平与上述通路中的基因表达呈正相关，即当SMC4基因表达上调时，上述通路被激活。

表3 SMC4的通路富集分析

3 讨论

探索具有高敏感性和特异性的胰腺癌生物标志物是改善胰腺癌患者生存预后的关键措施之一[3]。SMC4在乳腺癌[5]、结直肠癌[7]、胶质瘤[8]及肝癌[11]中高表达，参与了肿瘤增殖、侵袭和转移，并与其不良预后密切相关。然而，目前国内外关于SMC4在胰腺癌功能及机制方面的研究甚少。

本研究基于本院临床样本及生物信息学技术，系统分析了SMC4 在胰腺组织中的差异表达，并全面评估其表达差异对胰腺癌预后的诊断价值。分析结果显示，SMC4 在胰腺癌组织中的表达显著高于正常胰腺组织。SMC4 高表达组胰腺癌患者的生存时间显著低于SMC4低表达组患者，进一步Cox回归分析结果证实，SMC4 高表达可能是胰腺癌独立的不良预后因子。Huang等[5]报道SMC4高表达和表皮生长受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）高表达水平均是导致三阴性乳腺癌发生的危险因素，可作为辅助诊断指标。SMC4的高表达是结直肠癌患者生存率不佳的一个独立危险因素[12-13]。SMC4在胶质瘤组织中的蛋白和mRNA表达水平均显著高于正常脑组织，SMC4 表达升高与肿瘤进展和胶质瘤患者总体生存率有关，是胶质瘤药物治疗中的一个有价值的预后因素和潜在靶点[8，14]。可见SMC4可能是胰腺癌的一个独立预后因子，可为胰腺癌的早期诊断提供重要的支持证据。

SMC4 在胰腺癌中的功能不明确，Pandey等[15]报道SMC2 与SMC4 是相互作用蛋白，在疟原虫生命周期的非典型有丝分裂中起着关键作用，可能在不同的增殖阶段发挥不同的功能，它们的去除或消耗会导致寄生虫的发育受损，并阻止传播。Robellet等[16]报道SMC4与CDK1相互作用增加癌细胞增殖，且SMC4 的高表达可促进PLK1 的上调进而增加内质网转录活性及相关细胞入侵。上述研究结果证实SMC4通过与相互作用蛋白SMC2、CDK1、PLK1作用发挥功能。本研究结果提示与SMC4 相互作用的蛋白还有NCAPH、NCAPG、NCAPD2、NCAPD3、NCAPG2、NCAPH2、AURKB等，可为SMC4的功能研究提供新线索。

目前，SMC4 在胰腺癌中发挥功能的具体机制不明。Huang等[5]报道当SMC4 表达下调时，PI3K/AKT信号通路的激活失效，从而抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移。SMC4在肝癌中表达上调，可有效促进肝癌进展及侵袭[6，11]。但miR-219表达水平增加可导致SMC4表达水平显著下降，进而下调JAK2/Stat3的表达，在肝癌中发挥肿瘤抑制作用。Jiang等[14]的研究结果表明过表达SMC4通过激活TGF-β/Smad信号通路促进胶质瘤细胞增殖率、迁移和侵袭能力。本研究利用GSEA富集分析预测SMC4在胰腺癌中发挥功能的可能信号通路有JAK STAT信号通路、TGF-β信号通路，与文献报道[17]一致。除此之外，还预测到ERBB信号通路、Wnt信号通路、Notch信号通路、VEGF信号通路等，可为SMC4在胰腺癌中的机制研究提供更多线索和思路，值得进一步探讨与证实。

综上所述，SMC4在胰腺癌中高表达，且与胰腺癌不良预后密切相关，表现为癌基因特性，可能在胰腺癌发生发展中发挥促癌作用，有望成为胰腺癌诊治的新靶点和生物学标志物。