香梨优斑螟EPSXL基因生物信息学及表达分析

贺鹏鹏 张来斌 肖海兵 刘振亚 杨明禄 韩旭

摘    要：决定香梨优斑螟性别的基因尚不清楚，推测香梨优斑螟Sex-lethal（EPSXL）基因是潜在的主要性别决定基因，拟研究其在雌、雄个体不同组织及发育时期的表达。利用生物信息学软件预测香梨优斑螟EPSXL基因的氨基酸序列、分析蛋白质特性和构建近缘物种进化树，并采用荧光定量PCR技术检测该基因在头、胸、腹、翅中的表达情况。发现EPSXL基因编码区长度为1 005 bp，编码334个氨基酸，具有2个保守的RRM结构域。其蛋白为碱性亲水性蛋白质，二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主，有51个磷酸化位点和2个N-糖基化位点，不存在跨膜结构及信号肽。对比发现，EPSXL氨基酸序列与脐橙螟ATSXL的序列相似性最高。在雄性香梨优斑螟中EPSXL在成虫期和蛹期中mRNA表达量较高，在雌性中则在1龄和3龄幼虫期中表达量较高，在雄性腹部和胸部中的表达量极显著高于雌性相应组织。EPSXL蛋白具有2个保守的功能结构域，该基因mRNA表达在不同性别与组织间差异明显，能够为深入研究其功能提供理论依据。

关键词：香梨优斑螟;EPSXL基因;生物信息学;基因表达

中图分类号：S436.612.2+9             文獻标识码：A             DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2022.04.001

Bioinformatics and Expression Analysis of EPSXL Gene of Euzophera pyriella

HE Pengpeng1， ZHANG Laibin1， XIAO Haibing1，2， LIU Zhenya1，2， YANG Minglu1，2， HAN Xu1，2

（1.College of Agriculture， Tarim University， Alar， Xinjiang 843300， China; 2.Southern Xinjiang Key Laboratory of IPM of Tarim University，Alar， Xinjiang 843300， China）

Abstract：The gene that determines the sex of Euzophera pyriella is still unclear. It is speculated that the Sex-lethal（EPSXL） gene of E. pyriella is a potential major sex-determining gene. This research aims to study its expression in different tissues and developmental stages of female and male individuals. Bioinformatics software was used to predict the amino acid sequence of EPSXL gene， to analyze the protein characteristics and construct the phylogenetic tree of its genetically close species. Quantitative PCR was applied to detect the expression of EPSXL gene in the head， thorax， abdomen and wing. It was found that the EPSXL gene coding region was 1 005 bp in length， encoded 334 amino acids， and had 2 conserved RNA recognition motif （RRM） domains. The protein was a basic hydrophilic protein. The secondary structure was mainly constituted by alpha helix and random coils. There were 51 phosphorylated sites and 2 N-glycosylation sites， but no transmembrane structure and signal peptide. By comparison， it was found that the amino acid sequence of EPSXL had the highest similarity with the sequence of Amyelois transitella. The mRNA expression of EPSXL was higher in the adult and pupal of the male， while it was higher in the 1st and 3rd instar larvae of the female. The mRNA expressions of EPSXL in the abdomen and thorax of males were significantly higher than those in the female tissues. EPSXL protein has two conserved functional domains， and its mRNA expression differed obviously between gender and tissue， which can provide a theoretical basis for in-depth study of its function.

Key words： Euzophera pyriella;EPSXL gene;bioinformatics;gene expression

香梨优斑螟（Euzophera pyriella Yang）屬鳞翅目螟蛾科斑螟亚科优斑螟属，主要危害梨、苹果、杏、桃和枣等果树。其中，危害最重的是库尔勒香梨，部分产区被害率高达90%，危害严重时可造成树体衰弱死亡[1]。随着动物基因组测序技术的快速发展，目前有关昆虫雌雄性别发育相关基因的研究已有一定进展，性别决定的开关Sex-lethal（SXL）基因已经在多个物种中被鉴定出来，包括黑腹果蝇、家蚕、罗氏沼虾、东亚飞蝗、克氏原螯虾和烟粉虱等[2-7]。在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）性别决定机制中关于SXL基因研究较为深入，SXL基因的作用是通过激活其活化蛋白来控制生物体细胞的性别分化、生殖细胞的分化以及剂量补偿[4]。在果蝇体内X∶A的信号调控SXL基因表达，当比值为1时，SXL活性蛋白被激活，用来调控下游性别分化相关基因的表达，使果蝇个体发育成雌性;反之果蝇个体发育成雄性[8]。果蝇属以外，如地中海实蝇等昆虫母体transformer（TRA）基因替代SXL的作用，TRA基因通过自我调控而形成雌特异性的剪接，进而调控下游的doublesex（DSX）基因[9]。家蚕中，SXL基因在雌雄之间差异表达，可能与其性别决定有关，但家蚕基因组中没有TRA基因[10]，可能与PSI和HRP28基因的调节有关[11]。由此可见，调控途径上游的基因在不同昆虫中有较大的变异，而底端的DSX基因较为保守[12]。

SXL是一个RNA结合蛋白，含有两个RNA识别结构域（RNA recognition motifs，RRM）[3]，该蛋白除了结合自身发生正向自我调控功能以外，还调控除家蚕外的其他昆虫TRA和male-specific lethal-2（MSL-2）[10]。SXL蛋白通过结合SXL RNA转录本，选择具有雌性特异性的RNA剪接，使SXL蛋白具有功能性;其次是通过结合TRA RNA转录本，选择具有选择性剪接的TRA转录本，使TRA调控蛋白具有活性与transformer 2（TRA-2）共同作用于DSX的转录本，经一系列调控及编码过程使个体向着雌性方向分化发育[13]。

随着分子生物学及计算机的发展，大数据和生物信息学工具在生命科学研究中发挥越来越重要的作用，软件能够较为准确的预测基因功能。本研究利用生物信息学方法，对EPSXL基因进行生物学特性分析，利用荧光定量qPCR技术研究不同发育时期及组织的表达特征，为后期该基因功能研究奠定基础。1 材料和方法

1.1 试虫

EPSXL基因序列来自课题组香梨优斑螟转录组测序数据，香梨优斑螟试虫来自实验室饲养种群。

1.2 生物信息学分析

使用在线生物软件ORF finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）预测EPSXL基因的开放阅读框及编码区序列组成，利用ExPASy数据库的ProtParam（http：//www.exPasy.org/tools/protparam）软件对EPSXL蛋白的理化特性进行分析。用DNAMAN软件对各物种的SXL氨基酸序列进行比较分析。利用SMARTS在线软件（https：//smartsm.embl-heidelberg.de/）预测结构域。选用MEGAX软件中的邻接法（Neighbor-Joining）对EPSXL及NCBI数据库中相似度较高的氨基酸序列构建系统进化树，其中自展值（Bootstrap-value）设为1 000次，检验各节点的置信度。

1.3 总RNA的提取和cDNA的合成

每个处理分别收集香梨优斑螟卵40枚、1龄幼虫10头、3龄幼虫雌雄各3头、5龄幼虫雌雄各3头、雌雄蛹各5头、雌雄成虫各5头，以及雌雄成虫20只解剖后得到头、胸、腹、翅组织样品。每一个处理3个生物学重复，采集后的样品经液氮罐速冻后于-80 ℃冰箱保存备用。采用Trizol法提取各个试验样品的总RNA。利用核酸检测仪检测含量与质量，检测合格后保存于-80 ℃冰箱备用;根据反转录试剂盒（MightyScript第一链cDNA合成Master Mix）说明进行反转录，获得cDNA样品-20 ℃保存备用。

1.4 荧光定量PCR及分析

在该基因保守区利用Primer Premier5.0软件设计荧光定量PCR引物（表1），选取TUB为内参基因，使用SGExcel Ultra SYBR Mixture试剂盒和荧光定量PCR仪（Eppendorf Mastercycler ep realplex）进行相对定量分析。反应程序：95 ℃预变性2 min;95 ℃变性5 s;60 ℃退火20 s;40个循环，并设置溶解曲线温度变化95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。使用2-△△Ct法分析香梨优斑螟SXL基因在不同发育时期及组织的相对表达情况，以软件GraphPad Prism 8对数据统计分析，使用单因素方差分析方法进行显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 EPSXL基因的序列分析

EPSXL基因序列的编码区为1 005 bp，共编码334个氨基酸。EPSXL蛋白相对分子质量为37 170.76，分子式为C1641H2495N481O481S16，理论等电点为9.23，脂肪系数为52.63，平均亲水系数为-0.705（亲水），不稳定系数为39.18，EPSXL蛋白在体外可能较稳定。该蛋白序列不存在信号肽和跨膜区。二级结构主要是无规则卷曲和α螺旋为主，有2个N-糖基化位点和51个磷酸化位点，其中第109和185处为N-糖基化位点，苏氨酸磷酸化位点15个，丝氨酸磷酸化位点18个，酪氨酸磷酸化位点17个。

2.2 EPSXL氨基酸序列分析

通过NCBI检索获得其他昆虫SXL蛋白的氨基酸序列，使用DANMAN软件将所得氨基酸序列与其他昆虫的SXL氨基酸序列进行多重比较分析，香梨优斑螟（Euzophera pyriella）與脐橙螟蛾（Amyelois transitella）、地中海粉螟（Ephestia kuehniella）、粉纹夜蛾（Trichoplusia   ni）、草地贪夜蛾（Spodoptera  frugiperda）和斜纹夜蛾（Spodoptera litura）的SXL氨基酸序列相似性高达91.99%（图1）。通过SMARTS在线软件分析发现，该基因存在两个RRM结构域，属于SXL家族（图2）。

为了解香梨优斑螟SXL基因与其他昆虫的进化关系，使用MEGA-X软件将香梨优斑螟（Euzophera pyriella）与脐橙螟蛾（Amyelois transitella）、地中海粉螟（Ephestia kuehniella）、蜡螟（Galleria mellonella）、烟草天蛾（Manduca sexta）、粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）、草地贪夜蛾（Spodoptera  frugiperda）、斜纹夜蛾（Spodoptera litura）、偏瞳蔽眼蝶（Bicyclus anynana）、小菜蛾（Plutella xylostella）、家蚕（Bombyx mori）、菊黄花粉蝶（Zerene cesonia）的SXL基因氨基酸序列采用邻接法构建系统进化树，bootstrap-value设置为1 000次。EPSXL蛋白与脐橙螟聚为一支（图3），两者亲缘关系最近，其次是地中海粉螟。

2.3 EPSXL在不同发育时期的表达分析

EPSXL在不同发育时期中都有表达，但存在着较大的差异，3龄以后雌雄之间差异明显（图4），雄成虫期的表达量达到高峰，其次是蛹期、1龄幼虫期和3龄幼虫期，其他时期EPSXL表达量相对较低;雌虫则是1龄幼虫期的表达量最高，其次是3龄幼虫期，其他虫态表达量相对较低。

2.4 EPSXL在成年雌雄不同组织中的表达分析

EPSXL成虫雌雄性组织中均有所表达，但不同的组织中存在着较大的差异（图5），EPSXL成虫腹部表达量最高，其次是胸部和翅，头部组织最低;EPSXL在头部中的表达水平不存在雌雄差异;在雌性翅的EPSXL表达量极显著高于雄性;而腹部和胸部组织中雄性表达水平极显著高于雌性。

3 讨论与结论

SXL家族蛋白在不同生物体中具有较高的同源性，均具有2个保守的RRM结构域[3]。该结构域可能调控下游靶基因。包括TRA基因、TRA-2基因、DSX基因[5]、MSL-2基因等，这些基因与性别决定都有一定的关系[14-15]。本研究预测的氨基酸序列也具有2个保守的RRM结构域，EPSXL蛋白属于SXL家族具有高度保守性。

SXL基因在东亚飞蝗[5]、家蚕[10]和黑腹果蝇[15]各个发育时期和不同组织中均有表达，SXL活化蛋白将TRA、TRA-2等基因活化，活化后的基因统一作用于决定雌性性别的最后一个基因DSX[16]，并且还会导致生物体细胞的性别分化、生殖细胞的分化以及剂量补偿发生变化[4]。本研究得出SXL基因在香梨优斑螟的不同发育时期及组织中均有表达，但表达水平有较大的差异：雌雄成虫之间差异特别明显，推测表达情况与香梨优斑螟性器官发育过程有关;腹部中的表达水平最高，而在其他组织中的表达水平显著低于腹部，可能腹部存在精巢和卵巢，黑腹果蝇和家蚕在卵巢中表达明显高于其他组织[17-18]。虽然EPSXL基因大量存在于腹部中，但是该基因是否与香梨优斑螟性功能有关，还有待进一步研究。

参考文献：

[1] 鲁建英， 王小兵， 何元英. 香梨优斑螟的发生规律与防治研究[J]. 北方果树， 2013（3）： 9-11.

[2] 王慧超， 朱勇， 夏庆友. 黑腹果蝇的性别控制[J]. 遗传， 2003， 25（1）： 97-101.

[3] 石盼盼. 家蚕Bmsxl基因自身剪接的调控机理研究[D]. 重庆： 西南大学， 2017.

[4] 俞炎琴. 罗氏沼虾中性别发育相关基因Sxl和Dmrt基因的分子特征和功能研究[D]. 杭州： 浙江大学， 2013.

[5] 王鹏. 东亚飞蝗Sex-lethal基因的克隆、表达及功能初步研究[D]. 重庆： 重庆师范大学， 2014.

[6] 费佳敏， 石林林， 李艳和. 克氏原螯虾sex-lethal基因的克隆与表达分析[J]. 华中农业大学学报， 2021， 40（1）： 120-128.

[7] 刘雅婷. 烟粉虱性别决定基因的注释与功能研究[D]. 长沙： 湖南农业大学， 2018.

[8] S?NCHEZ L. Sex-determining mechanisms in insects[J]. The International Journal of Developmental Biology，2008， 52（7）： 837-856.

[9] LAGOS D， KOUKIDOU M， SAVAKIS C， et al. The transformer gene in Bactroceraoleae：  the genetic Switch that determines its sex fate[J]. Insect Molecular Biology，2007， 16（2）： 221-230.

[10] 查幸福. 家蚕（Bombyxmori）性别决定网络及其关键基因BmSxl的cDNA克隆和功能研究[D]. 重庆： 西南大学， 2006.

[11] SUZUKI M G. Sex determination： insights from the silkworm[J]. Journal of Genetics， 2010， 89（3）： 357-363.

[12] CHEN S， YANG P， JIANG F， et al. De novo analysis of transcriptome dynamics in the migratory locust during the development of phase traits[J]. PLOS one， 2010， 5（12）： e15633

[13] MOSCHALL R， STRAUSS?D， GARC?A-BEYAERT M， et al. Drosophila Sister-of-Sex-lethal is a repressor of translation[J]. RNA （new York， N. Y. ）， 2018， 24（2）： 149-158.

[14] SACCONE G， PELUSOI， ARTIACO D， et al. The ceratitiscapitata homologue of the drosophila sex-determining gene Sxl is structurally conserved，but not sex-specifically regulated[J]. Development， 1998， 125（8）： 1495-1500.

[15] WANG M， XIE X， XU D， et al. Molecular characterization of the Sex-lethal gene in mud crab Scylla paramamosain and its potential role in sexual development[J]. Comparative Biochemistry and Physiology.Part B， Biochemistry & Molecular Biology， 2020， 250： 110486.

[16] RUIZ M F， GODAY C， GONZ?LEZ P， et al. Molecular analysis and developmental expression of the Sex-lethal gene of Sciaraocellaris （Diptera order， Nematocera suborder）[J]. Gene Expression Patterns： GEP， 2003， 3（3）： 341-346.

[17] LI X， LIU Q， LIU H， et al. Mutation of doublesex in Hyphantriacunea results in sex-specific sterility[J]. Pest Management Science，2020， 76（5）： 1673-1682.

[18] 宛秋興. Sex lethal（BmSxl）基因在家蚕生殖细胞调控中的功能研究[D]. 重庆： 西南大学， 2021： 003217.