沙奎那韦对脂多糖诱导急性肺损伤大鼠PI3K-AKt-NF-κB信号通路的影响*

何达，张莉，席俊峰

（榆林市第一医院呼吸内科，榆林 719000）

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是一种破坏性的呼吸系统疾病，其特征是肺泡快速受损、低氧血症严重、炎症反应和细胞因子积累，之后会发展为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），严重时可致死[1]。近年来，大规模临床试验和研究集中在ALI/ARDS上，使其在治疗策略方面取得了重大进展。然而，其临床死亡率仍居高不下[2]。目前，探究并开发有效的候选预防治疗药物仍然是ALI/ARDS治疗研究的主要焦点。

沙奎那韦（saquinavir，SQV）是一种HIV蛋白酶抑制剂，能够抑制HIV蛋白酶的生物活性，终止HIV病毒的复制。SQV是一种安全性的药物。除了抗病毒活性外，SQV对癌症、炎症和免疫介导疾病等也有良性作用[3-5]。已有研究表明，SQV能够改善肝脏缺血再灌注引起的远处肺组织损伤，其能改善肺水肿，并能降低模型中炎症反应的水平[6]。ALI发展为ARDS的原因之一可能始于炎症反应[7-8]，其中NF-κB信号通路是炎症因子的主要调控通路。研究表明，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）信号通路与NF-κB信号通路存在联系，Akt磷酸化活化IKK，导致NF-κB的抑制剂IKB下调，当IKB下调，NF-κB不再与之结合，于是后者从胞质被释放，然后进入核内并引起相关基因的转录，进而介导多种生长因子等诱发的细胞生长，并经多种途径促调控细胞的增殖、分化、凋亡等[9-10]。表明PI3K/Akt通路与其他因素共同作用，增加NF-κB通路的激活[11-12]，从而调控了细胞凋亡和炎症反应等。本研究利用大鼠建立脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的ALI模型来观察SQV在ALI中的抑制炎症反应和抗细胞凋亡作用，并探讨其可能机制，为ALI/ARDS的预防治疗提供新的治疗策略。

1 材料与方法

1.1实验材料SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠36只，体重230～300 g，购自西安交通大学实验动物中心；沙奎那韦（CAS号：127779-20-8）购自上海阿拉丁生化科技有限公司；苏木精—伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色试剂盒、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗均购自北京索莱宝生物科技公司；TUNEL染色试剂盒购自瑞典Roche公司；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）的ELISA检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；兔抗大鼠PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBa、GAPDH抗体购自美国Cell Sigaling公司。

1.2 LPS诱导的急性肺损伤大鼠模型与分组 造模前，所有SD大鼠在干净通风的动物房环境适应性饲养2周，期间恒定昼夜循环（12 h∶12 h），定时补充食物和水。按照随机选择方法将大鼠分为3组，即对照组（Control组）、LPS模型组（LPS组）、SQV处理的LPS模型组（LPS+SQV组），每组12只。参考文献[12]的方法对LPS+SQV组大鼠在LPS造模前5 d予以200 mg/kg·d-1的SQV灌胃处理，每天1次，连续5 d，而对Control组与LPS组大鼠则采取等体积的生理盐水灌胃处理。第5天参考文献[6,13]的方法对LPS组和LPS+SQV组大鼠采用腹腔注射5 mg/kg的LPS制备ALI模型；造模12 h后，腹腔注射120 mg/kg戊巴比妥处死大鼠，进行后续实验。实验方案经本院伦理委员会批准。

1.3 HE检测肺组织病理学变化 将肺组织标本进行石蜡包埋和切片处理，切成4μm厚度。组织切片载于载玻片上，二甲苯脱蜡，分级乙醇稀释和蒸馏水复水，按照HE试剂盒说明书染色。光镜下观察肺组织病理切片，并分析病理学变化。

1.4肺组织湿/干比重测定 戊巴比妥处死大鼠后，取左肺上叶，肺表面的水用滤纸吸干，对样品进行准确称重，记为湿重（W）。将其放入恒温烘干箱中，设置温度为75℃，烘烤至样品恒重，然后记录称量数据为干重（D）。计算肺组织湿/干比重（W/D）比值，评价肺组织水肿程度。

1.5 TUNEL染色检测肺组织细胞凋亡取4%甲醛固定后的肝组织，石蜡包埋切片至4μm后，脱蜡处理后0.2%Triton X-100透化10 min，加入50μmol/L的TUNEL试剂于37℃下避光孵育30 min，37℃下DAPI试剂染核6 min，最后在激光共聚焦显微镜下，随机选择视野观察TUNEL阳性细胞数（×400）。

1.6 ELISA检测支气管肺泡灌洗液中炎症相关因子的含量 建模后12 h后，戊巴比妥麻醉各组大鼠，切开颈部分离出气管，插管后用无菌PBS灌洗3次，将灌洗液-80℃保存备用。将收集到的支气管肺泡灌洗液取出，按照ELISA检测试剂盒说明书操作，通过使用设备检测在450 nm处吸光度值，测定TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的含量变化

1.7 Western blotting检测肺组织蛋白 取大鼠左肺组织加入裂解液匀浆，提取总蛋白质。采用BCA法测定提取物的蛋白浓度。用SDS-PAGE对蛋白进行分离，之后转在PVDF膜上，脱脂牛乳封闭1 h，并使用一抗p-PI3K（1∶800）、PI3K（1∶1 000）、p-Akt（1∶800）、Akt（1∶1 000）、p-NF-κB p65（1∶800）、NF-κBp65（1∶1 000）、IκBa（1∶200）和GAPDH（1∶1 000）4℃过夜进行孵育，之后用山羊抗兔二抗37℃孵育2 h，之后使用Image J软件进行Western blotting定量分析。

1.8统计学方法 采用GraphPad Prism 5.0进行统计学分析并作图。计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析。每组实验至少进行3次重复。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SQV改善LPS诱导的大鼠ALI肺组织切片HE染色结果显示，与Control组正常肺组织比较，LPS组肺泡间质充血、肺泡间隔增厚、炎性细胞浸润，能观察到明显的病理性变化；而LPS+SQV组中，肺组织的病理情况明显改善，肺泡间隔增厚减少，间质充血减少；在W/D测定结果中，与Control组比较，LPS组和LPS+SQV组W/D比值增加；而LPS+SQV组W/D比值较LPS组降低，见图1。

图1 SQV对LPS诱导的大鼠肺组织的影响

2.2 SQV改善LPS诱导的肺组织细胞凋亡与Control组比较，LPS组和LPS+SQV组细胞的凋亡上升；与LPS组比较，LPS+SQV组肺组织细胞凋亡降低,见图2。

图2 TUNEL染色观察SQV对LPS诱导各组大鼠肺组织细胞凋亡情况（×400）

2.3 SQV改善LPS诱导的大鼠肺组织中炎症因子的表达LPS组和LPS+SQV组大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的含量较Control组均增高。与LPS组比较，LPS+SQV组大鼠IL-10的含量升高，而TNF-α、IL-1β、IL-6的含量却均下降，见图3。

图3 SQV对LPS诱导的大鼠肺组织中炎症因子含量的影响

2.4 SQV影响LPS诱导的大鼠肺组织中PI3KAKt-NF-κB通路相关蛋白的表达及磷酸化水平

与Control组比较，LPS组IκBa的表达水平下降，LPS+SQV组IκBa的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），而LPS组和LPS+SQV组PI3K磷酸化水平（p-PI3K/PI3K）、AKt磷酸化水平（p-AKt/AKt）、NF-κB p65的磷酸化水平（p-NF-κB p65/NF-κB p65）均升高；而与LPS组比较，LPS+SQV组IκBa的表达水平升高，其它检测蛋白的磷酸化水平下降（P＜0.05），见图4。

图4 SQV对LPS诱导大鼠肺组织中PI3K-AKt-NF-κB通路蛋白表达与磷酸化的影响

3 讨论

ALI/ARDS是一种以低氧血症和呼吸功能不全为特征的综合病症，现存的治疗策略虽然缓减了ALI/ARDS的发展，但年致死率仍达40%。为了寻找更为有效的预防治疗方法，本研究利用大鼠建立LPS诱导的ALI模型来观察SQV在ALI中的抑制炎症反应和抗细胞凋亡作用，以期为ALI/ARDS的预防治疗提供依据。

LPS是细菌细胞壁的主要成分，被认为是ALI/ARDS发生的关键因素。暴露于LPS环境，能导致炎症细胞浸润，导致细胞因子和趋化因子的产生，随后导致ALI/ARDS炎症反应的启动和传播，加快病情的恶化[15]。并且，LPS诱导的ALI大鼠模型更接近于人体由于长期低氧血症和某些形式的肺损伤导致的病理改变。本研究选择以5 mg/kg的剂量腹腔注射LPS，创建ALI模型。HE检测结果表明，模型中存在严重的组织病理，同时，肺组织W/D的比值升高也说明，LPS诱导的ALI导致了肺组织的病理性水肿。而连续5 d予以SQV处理可减少模型组织病理损伤。提示SQV持续处理可减轻组织病理学损伤，缓解ALI的发展。

炎症反应与细胞凋亡是肺损伤模型中典型的病理特征。NF-κB是炎症反应的重要通路，而PI3K-AKT是NF-κB的上游通路。其中，Akt是重要分子，在促炎细胞因子介导的ALI/ARDS的发生中起关键作用[16-17]。Akt可靶向核转录因子NF-κB调控多个基因的表达，而这些基因是导致多种炎症疾病进展的重要因素。探索影响这些信号通路的候选药物可能是帮助预防和治疗LPS诱导ALI的关键一步。

炎症反应在肺损伤进展中起重要作用[18]。TNF-a主要由单核巨噬细胞和淋巴细胞激活、产生和释放，是一种强大的炎症介质。研究表明，TNF-a具有增加肺泡毛细血管通透性，减少肺泡内液体清除率的能力，与IL-1β、IL-6[19]具有类似的作用。而IL-10可抑制中性粒细胞激活，抑制促炎细胞因子的产生，保护肺组织免受损伤[20]。在本研究LPS诱导的ALI中，TNF-a、IL-1β、IL-6促炎因子的表达异常升高，抑制炎症因子IL-10相对低表达，并且从模型能观察到明显的病理性变化。既往研究表明，SQV可以抑制NF-κB通路相关因子的活化[21-22]，从而在多种疾病中发挥保护作用。本研究也证实了SQV处理后可显著抑制促炎因子TNF-a、IL-1β和IL-6的表达，增加IL-10的表达。NF-κB是调节炎症因子[23]表达的关键核转录因子。本研究还检测了IκBa的表达和NF-κB p65蛋白的磷酸化。结果与以往研究一致，SQV通过抑制NF-κB p65蛋白磷酸化，减少了过量细胞因子的产生。因此，SQV可以通过NF-κB途径抑制LPS诱导大鼠促炎症因子的表达。

细胞凋亡是肺损伤的另一个关键特征，已有研究表明，通过调控PI3K-AKT-NF-κB信号通路影响肺组织细胞的炎症和凋亡，从而改善肺损伤情况[24]。表明抗凋亡可能是保护肺损伤的另一机制。本研究研究发现，在LPS诱导ALI后，观察到大量凋亡细胞，且PI3K蛋白磷酸化、Akt蛋白磷酸化、NFκB p65蛋白磷酸化水平均升高，说明PI3K-AKT-NF-κB通路被激活；SQV处理过的大鼠，肺组织中PI3K蛋白磷酸化、Akt蛋白磷酸化、NF-κB p65蛋白磷酸化水平及凋亡指数均明显降低。说明SQV通过抑制LPS攻击细胞凋亡改善肺组织病理损伤，即抑制PI3K-AKT-NF-κB通路可修复LPS对肺组织造成的损伤。本研究结果表明，LPS诱导的ALI中炎症反应和细胞凋亡之间存在联系。

综上所述，SQV对LPS诱导的大鼠ALI有保护作用。其机制可能是SQV通过抑制PI3K-AKT-NFκB信号通路，降低细胞凋亡与炎症反应而缓减ALI。因此，SQV可能是ALI/ARDS期间预防和治疗的一种有前途的药物，这将为ALI/ARDS的预防和治疗提供新的治疗策略和方向。