血清miR-647 PTEN与ACS患者PCI术后支架内再狭窄的关系

徐 晶, 白 净

(陕西省人民医院心血管内科, 陕西 西安 710068)

经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)是急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)常用血管重建方法之一，能快速疏通狭窄或闭塞冠状动脉管腔，改善心肌血流灌注。但PCI后即使规范用药仍有较高几率出现支架内再狭窄，严重影响患者预后。新生动脉粥样硬化(neo atherosclerosis，NAS)是第二代药物洗脱支架后支架内再狭窄和支架晚期治疗失败最重要病理机制，与血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMS)增殖、迁移密切相关[1,2]。微小RNA(microRNAs，miRNA)参与多种细胞因子转录调控，能通过调控VSMS增殖、迁移促进动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)发生发展[3]。第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)是一种多功能蛋白，研究报道其能抑制VSMS增殖、迁移，参与AS病理发展过程[4]。本研究旨在分析ACS患者血清miR-647，PTEN水平变化，探讨二者与PCI后支架内再狭窄的关系，以前为临床早期防治提供参考。

1 材料与方法

1.1研究对象:选取2019年1月至2020年5月我院收治的209例接受PCI的ACS患者。纳入标准：①符合《急性冠脉综合征急诊快速诊治指南》[5]ACS诊断标准；②首次确诊，发病至就诊时间<24h；③具备PCI指征；④年龄18～<80岁；⑤临床资料完整者。排除标准：①既往血管旁路手术治疗或PCI史；②近期接受外科手术治疗者；③不能接受随访者；④合并恶性肿瘤者；⑤肝、肾等重要脏器功能损害者；⑥先天性心脏病者；⑦合并免疫、血液系统疾病者；⑧合并急慢性感染者。本研究经伦理委员会批准。

1.2仪器与试剂:PCR扩增仪购自赛默飞世尔科技公司；Trizol试剂盒购自北京柏莱斯特科技发展有限公司；Takara和qPCR试剂盒购自宝日医生物技术有限公司；PTEN试剂盒：北京百奥莱博科技有限公司。

1.3方 法

1.3.1基础资料收集:收集患者基础资料，包括性别、年龄、体质指数、吸烟史、饮酒史、病史、病变支数、支架数量、支架内径、支架长度、Killip分级(分为Ⅰ～Ⅳ级)、Gensini积分(总分为冠脉狭窄程度计分×病变部位计分)和PCI术后次日空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)。

1.3.2血清miR-647，PTEN水平检测:采集患者PCI术后次日清晨空腹静脉血，3000rpm/min离心20min (半径8cm)，取上清存于-80℃冰箱中至检测。部分血清使用Trizol试剂盒提取总RNA，Takara逆转录试剂盒合成cDNA，进行qPCR扩增。miR-647上游引物：5'-GTGTTGGCCTGTGGCTG-3'，下游引物：5'-CTGACCCTCCCTCCTGC-3'；内参U6上游引物：5'-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3'，下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。20μL反应体系：2μL cDNA模板、1μL引物、10μL qPCR Master Mix、6μL RNase-Free ddH2O；反应条件：95℃ 10min (1个循环)，95℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 30s (40个循环)。目标基因血清相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。部分血清使用ELISA检测PTEN水平，所有操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.3支架内再狭窄判定:支架内再狭窄定义为冠状动脉造影证实支架两端和/或全程5mm节段内管腔丢失，管腔狭窄程度≥50%[6]。所有患者PCI后均随访1年，根据是否发生支架内再狭窄分为再狭窄组和无再狭窄组。

2 结 果

2.1两组患者基础资料比较:随访1年，209例ACS患者PCI术后1年共出现45例支架内再狭窄，发生率为21.53%(45/209)。再狭窄组支架内径小于无再狭窄组，支架长度长于无再狭窄组，HDL-C水平低于无再狭窄组，Gensini积分高于无再狭窄组(P<0.05)。见表1。

表1 两组患者基础资料比较±s，n(%)]

2.2两组患者血清miR-647，PTEN水平比较及相关性:与无再狭窄组比较，再狭窄组血清miR-647显著降低，有统计学差异(1.02±0.25 vs.0.79±0.20，t=6.635，P<0.001)；PTEN显著升高，有统计学差异(2.38±0.85 vs.3.52±1.13，t=-6.291，P<0.001)。ACS患者血清miR-647与PTEN水平呈负相关(r=-0.701，P<0.001)。见图1。

图1 血清miR-647与PTEN水平的线性散点图

2.3ACS患者PCI术后支架内再狭窄影响因素的多因素Logistic回归分析:以支架内径、支架长度、HDL-C，Gensini积分、miR-647，PTEN为自变量，PCI术后支架内再狭窄(是=1，否=0)为因变量，支架内径、PTEN为PCI术后支架内再狭窄独立保护因素，Gensini积分、miR-647为独立危险因素(P<0.05)。见表2。

表2 ACS患者PCI术后支架内再狭窄影响因素的多因素Logistic回归分析

2.4血清miR-647，PTEN水平对ACS患者PCI术后支架内再狭窄的预测价值:miR-647+PTEN预测ACS患者PCI术后支架内再狭窄的AUC大于各指标单独预测(Z=2.971、2.521，P=0.003、0.012)。见表3、图2。

图2 血清miR-647，PTEN水平预测ACS患者PCI术后支架内再狭窄的ROC曲线

表3 血清miR-647 PTEN水平对ACS患者PCI术后支架内再狭窄的预测价值

3 讨 论

目前随着全国各地的ACS区域协同救治体系的逐渐完善，极大的降低了ACS死亡率，但PCI后支架内再狭窄仍然是一个难题。NAS指支架术后新生内膜组织中迅速聚集富含泡沫的巨噬细胞，伴或不伴钙化和/或坏死核心，VSMS是血管壁中层最丰富的细胞类型，在某些应激条件下分化、增殖、迁移能促进坏死脂质核心和纤维帽形成，在AS发生发展及血栓形成中发挥重要作用[7]。

miRNA是一组非编码小分子RNA，能抑制靶miRNA翻译在转录后水平调控基因的表达，近年研究表明，miRNA能通过调控炎症反应、VSMS、血管内皮细胞等途径参与PCI术后支架内再狭窄发生[8]。miR-647位于染色体20q13.33，已被认为一系列癌症的肿瘤抑制因子。长链非编码RNA- APPAT(LncRNA APPAT)与AS形成和冠状动脉严重狭窄有关，近年研究发现心肌梗死后VSMS和循环中miR-647表达均上调，且与LncRNA APPAT表达呈负相关，提示miR-647可能参与AS发展[3]。本研究结果显示，再狭窄组血清miR-647表达升高，是导致PCI术后支架内再狭窄的独立危险因素，分析与miR-647能促进VSMS增殖、迁移参与NAS形成有关。Xu等[9]使用氧化型低密度蛋白处理人主动脉VSMC建立体外AS模型发现，miR-647表达上调，敲低miR-647能抑制VSMC增殖、迁移。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路广泛调控细胞增殖、黏附、分化、迁移、凋亡等功能，该信号通路异常活化往往与细胞恶性转化有关，也能通过促进VSMS增殖、迁移参与AS进展[10]。PTEN不仅是一种多功能蛋白，还是分化的VSMS表型的一个重要调节剂，研究发现VSMS脱落正常生长抑制机制后，其内PTEN活性丧失，敲除小鼠动脉中膜和内膜中PTEN后能加速AS进展[11]。研究表明，PTEN的去磷酸化作用能使磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路去磷酸化，进而抑制该通路的活性，通过上述途径抑制AS进展[12]。本研究结果显示，再狭窄组血清PTEN水平降低，是PCI术后支架内再狭窄的独立保护因素，说明PTEN参与PCI术后支架内再狭窄发生，考虑与PTEN能抑制VSMS增殖、迁移抑制NAS形成有关。本研究显示，ACS患者血清miR-647与PTEN水平呈负相关，说明二者可能共同参与支架内再狭窄发生。研究发现，PTEN为miR-647的直接靶点，AS模型中PTEN能靶向抑制PTEN上调磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路活性，促进VSMS增殖、迁移。ROC曲线结果表明，血清miR-647，PTEN水平均可作为ACS患者PCI术后支架内再狭窄的预测指标，联合检测血能提高支架内再狭窄的预测能效。

综上所述，PCI术后支架内再狭窄ACS患者血清miR-647水平升高，PTEN水平降低，二者可能共同参与支架内再狭窄，可作为支架内再狭窄预测指标。但研究仅限于观察血清水平变化，未进一步分析二者参与支架内再狭窄中的机制。