蔓越莓制品对斑马鱼抗感染及炎症的抑制作用

付式杰，李爱民，吴晓磊，李子杰*

（1.江南大学生物工程学院，江苏无锡 214122）（2.国珍健康科技(北京)有限公司，北京 102206）

蔓越莓为常绿小灌木矮蔓藤植物，主要生长于北半球凉爽地带的酸性土壤中，表皮鲜红，口感酸甜清爽，目前已获得人们的青睐[1]。蔓越莓中具有较高含量的花青素、原花青素、花青苷、黄酮醇类以及酚酸类物质，其中原花青素具有极强的清除人体内自由基[2]、抑菌[3]和抗炎症活性[4]，在国际上受到了广泛关注。由于蔓越莓中含有大量具有生理活性的天然化学成分，其功能也被越来越多的学者进行研究。有研究表明，P菌毛阳性大肠杆菌是导致尿路感染主要毒力因子之一[5]，甚至是导致急性肾盂肾炎的罪魁祸首[6]，然而，服用蔓越莓汁可显著降低儿童患尿路感染的风险[7]。Liu等[8]通过热力学方法计算并比较吉布斯自由能和界面张力的变化，也证明了当P菌毛阳性大肠杆菌暴露在蔓越莓汁中时，其粘附性将会降低。詹凡等[9]的研究表明，是蔓越莓中大量活性成分使其具有较好的抗尿路感染的功能，并有研究通过UHPLC-DADMS/MS筛选出蔓越莓汁中的生物活性成分，发现其对多种致病菌均有较好的抗菌活性[10]。

另外，蔓越莓的抗炎症功能也引起了国内外学者的广泛关注。Mary等[11]的研究表明野生蔓越莓中的总酚和原花青素含量均高于野生蓝莓，且能对RAW 264.7细胞因脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激而分泌的IL-1β产生剂量依赖性抑制，且用蔓越莓提取物处理人单核细胞系THP-1并用LPS进行刺激，发现经过蔓越莓提取物处理的细胞肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factorα，TNF-α）含量显著低于对照组，且一些炎症相关基因的表达也被显著下调[12]，表明蔓越莓提取物中的生物活性成分具有较好的抗炎效果。为获得生物活性较高的蔓越莓制品，本文比较评价了市售和从新时代健康产业（集团）有限公司获得的三种蔓越莓制品。其中包括市售的高浓度蔓越莓精华（High Strength Cranberry）；将蔓越莓压榨后，取其果汁冻干，制成的蔓越莓果汁粉（MYMFA）；压榨后取其果汁与全果冻干得到的蔓越莓全果粉（MYMFB）和对蔓越莓中的原花青素进行提取，制成蔓越莓提取物粉（MYMFC）四种蔓越莓制品。

目前常用的炎症动物模型包括二甲苯致小鼠耳肿胀模型、大鼠足趾肿胀增加模型等[13]。然而由于啮齿动物模型周期长，成本高，若大量使用很难满足伦理要求。而斑马鱼模型由于具有繁殖快、成本低，身体透明且免疫细胞类型与人类相同等优点，已被广泛应用于细菌或病毒感染性模型中[14,15]。因此本文选用转基因中性粒细胞荧光斑马鱼，构建P菌毛阳性大肠杆菌感染模型，从而评价三种蔓越莓制品的抑菌与抗炎症能力。

1 材料与方法

1.1 实验动物

转基因中性粒细胞荧光斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后 4 d（4 day post-fertilization，4 dpf），共900尾用于进行浓度摸索实验，每实验组为30尾；共480尾用于抗感染作用评价实验，每实验组为30尾。

斑马鱼饲养于28 ℃的养鱼用水中（水质：每1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为480～510 μS/cm；pH为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6 mg/L CaCO3），由杭州环特生物科技股份有限公司养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为：SYXK（浙）2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。

1.2 材料与试剂

三金片，绿色薄膜衣片，0.29 g/片，实验前用超纯水配制成100 mg/mL的母液，-20 ℃保存；“MYMFA”，暗红色粉末，现配现用。“MYMFB”，暗红色粉末，现配现用。“MYMFC”，暗红色粉末，现配现用，上述药品均由新时代健康产业（集团）有限公司提供；“High Strength Cranberry”（市售，SWISS公司），红棕色胶囊，25 g/颗，除去胶囊壳，取其内部粉末，现配现用。

1.3 仪器与设备

SMZ645解剖显微镜，Nikon公司；6孔板，Nest Biotech；CP214精密电子天平，奥豪斯；IM-300显微注射仪，Narishige；PC-10拉针仪，日本Narishige；AZ100电动聚焦连续变倍荧光显微镜，Nikon公司。

1.4 方法

1.4.1 蔓越莓制品无可见有害作用水平（No Observed Adverse Effect Level，NOAEL）的确定

随机选取4 dpf转基因中性粒细胞荧光斑马鱼，用养鱼用水分别水溶给予检测浓度为100、500、1000、1500和2000 µg/mL的三金片、High Strength Cranberry、MYMFA、MYMFB、MYMFC，同时设置正常对照组（即养鱼用水处理斑马鱼），每实验组为30尾斑马鱼，置于28 ℃培养箱中培养至5 dpf。在实验过程中，每天观察记录斑马鱼的死亡情况并移除死亡的斑马鱼。待测制品处理结束后，统计各实验组的斑马鱼死亡数量，确定三金片与四种蔓越莓制品对斑马鱼的NOAEL。

1.4.2 蔓越莓制品抗感染作用评价实验

1.4.2.1 蔓越莓制品评价浓度的确定

根据三金片与4种蔓越莓制品NOAEL摸索实验的结果，选取NOAEL及其浓度的1/3、1/9作为后续实验中三金片与4种蔓越莓制品的给药浓度。

1.4.2.2 造模

将培养好的P菌毛阳性大肠杆菌，使用荧光染料CM-Dil标记后，以吞咽的方式移植到4 dpf转基因中性粒细胞荧光斑马鱼肠腔内，建立斑马鱼细菌感染模型，并根据斑马鱼肠腔内是否带有荧光判别是否造模成功。

1.4.2.3 蔓越莓制品抗感染效果的评价

通过将三金片与4种蔓越莓制品溶于养鱼水中分别对造模成功的斑马鱼进行给药，给药浓度以1.4.2.1确定的浓度为准，每个实验组为30尾斑马鱼，置于28 ℃培养箱中培养。另外对造模成功的30尾斑马鱼不进行给药处理，在相同条件下培养，作为模型对照组。培养至5 dpf时，每个实验组随机选择10尾斑马鱼在荧光显微镜下进行观察、拍照并保存图片；利用尼康NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼肠腔内细菌的荧光强度（S）和中性粒细胞个数（N），分别定量评价5个样品对细菌感染斑马鱼的抗菌消炎作用。

蔓越莓制品抑菌率和炎症消退率计算公式如下：

1.5 统计学方法

使用SPSS通过Dunnett’sT-检验进行统计学分析，p＜0.05为具有统计学差异，p＜0.01为具有显著性差异，p＜0.001为具有极显著差异；使用GraphPad Prism 8绘图。

2 结果与讨论

2.1 三金片和蔓越莓制品NOAEL水平的确定

本研究将每个实验组的30尾4 dpf转基因中性粒细胞荧光斑马鱼，分别通过养鱼用水，水溶给予检测浓度为100、500、1000、1500和2000 µg/mL的三金片、High Strength Cranberry、MYMFA、MYMFB、MYMFC后，置于28 ℃培养箱中培养至5 dpf。在此过程中，斑马鱼在正常对照组和给予100、500、1000、1500、2000 µg/mL浓度4种蔓越莓制品的实验组中均未出现死亡的情况；三金片在检测浓度为100、500和1000 µg/mL的实验组中斑马鱼亦未出现死亡情况；而在1500 µg/mL浓度组斑马鱼死亡13尾，死亡率为43.33%；2000 µg/mL浓度组斑马鱼死亡19尾，死亡率为63.33%（详见表1）。

表1 不同实验组中的斑马鱼在不同给药浓度（μg/mL）下的死亡率对照表Table 1 Mortality of zebrafish after given different concentrations (μg/mL) of different sample

根据上述结果，确定三金片对斑马鱼的NOAEL为1000 µg/mL，4种蔓越莓制品的NOAEL均为2000µg/mL。另外，斑马鱼在三金片浓度为1500 μg/mL、2000 μg/mL时均出现死亡，且浓度越高，死亡率越高，表明高浓度的三金片对斑马鱼具有毒副作用，而4种蔓越莓制品在相同浓度下并未并对斑马鱼的活力产生影响，与三金片相比，四种蔓越莓制品均具有更高的安全性。

2.2 蔓越莓制品抗感染效果的评价

2.2.1 给药浓度的选取

在之前研究的基础上分别选取斑马鱼对不同样品的NOAEL及其1/3、1/9的浓度进行给药，由此评价蔓越莓制品的抗感染效果。最终确定，三金片给药的低、中、高剂量分别为111、333和1000 µg/mL；4种蔓越莓制品给药的低、中、高剂量分别为222、667和2000 µg/mL。

2.2.2 抑菌作用效果评价

对通过吞咽方式移植P菌毛阳性大肠杆菌的转基因中性粒细胞斑马鱼分别给予三金片和4种蔓越莓制品后，斑马鱼体内的荧光情况及荧光强度如图1、图2所示。图中橙色荧光标记为P菌毛阳性大肠杆菌，绿色为中性粒细胞，白色虚线部分为斑马鱼的肠道区域，此区域为分析细菌感染和炎症的主要区域。由图2可知，相对于模型组，经过三金片和4种蔓越莓制品给药的斑马鱼肠腔内部荧光强度均有所降低，并且在给予低浓度（222 µg/mL）的MYMFB与MYMFC样品后，肠腔内部荧光强度分别降至11919和11432像素，与模型组相比呈现极显著差异（***p＜0.001），且降低程度随着给药浓度的增加而增加，体现出了较好的剂量依赖关系。

经过分析，三金片与4种蔓越莓制品的抑菌率如图3所示，5种样品均具有一定的抑菌能力，且抑菌能力呈现剂量依赖性。其中三金片的抑菌能力较好，在以高剂量（1000 μg/mL）进行给药时，抑菌率可以达到53.84%。然而，MYMFC在以相同NOVEL水平进行给药时，抑菌率达到了60.38%，高于三金片、High Strength Cranberry与MYMFA，表现出极强的抑菌能力。Rodríguez等[16]将蔓越莓中的活性物质提取后，发现其具有极强的抑菌作用，并在进行分离纯化后证明原花青素A二聚体是其中抑菌活性最强的组分，可有效降低细菌粘附，其生物膜形成率和表面疏水性分别达到了3.52%和91%。Alejo等[17]研究了不同浓度的原花青素的抑菌效果并发现当其浓度为0.1µg/mL时，对大肠杆菌生物膜形成的抑制率可达到30%。Silvan等[18]的研究表明，原花青素对幽门螺杆菌的生长有极强的抑制作用，与本研究中，含有最高原花青素含量的MYMFC具有最强的抑菌活性相符。因此，MYMFC极强的抑菌能力可能与其中高含量的原花青素有关。

2.2.3 蔓越莓制品炎症消退作用效果的评价

中性粒细胞在炎症过程中将迁移并聚集在炎症部位，激活单核细胞和巨噬细胞，从而激活炎症小体[19]，并释放大量炎症因子及活性氧[20]，是参与组织炎症损伤的主要细胞之一，其数量的变化是用来评估个体炎症反应的重要依据。本研究通过比较不同实验组斑马鱼肠道区域中性粒细胞的数量评价蔓越莓制品的抗炎效果。

给予不同药品及药量的斑马鱼体内的中性粒细胞数量如图4所示。结果表明，在给予低、中、高浓度的High Strength Cranberry与MYMFA后，斑马鱼体内的平均中性粒细胞数量分别39、37、30和40、38、31个，均小于模型对照组（43个），但均大于给予三金片、MYMFB和MYMFC后的平均中性粒细胞数量。其中斑马鱼在被给予高剂量的三金片后，其体内的中性粒细胞平均数量降至23个，与模型组相比呈现出极显著差异（***p＜0.001）。MYMFB虽然在高浓度给药后，将斑马鱼中性粒细胞数量降至25个，稍高于三金片给药组，但在中、低浓度给药时均使斑马鱼中性粒细胞数量低于相同水平的三金片给药组，展现出良好的抗炎能力。而MYMFC在各个浓度上的抗炎表现都优于同NOAEL水平的三金片，在高剂量给药后使中性粒细胞平均数量降至21个。

此外，四种样品对斑马鱼的炎症消退率如图5所示，由图可知三金片与4种蔓越莓制品均呈现出较好的炎症消退作用，其炎症消退率呈剂量依赖性。其中，三金片依然具有极显著的炎症消退作用（***p＜0.001），在给药浓度为1000 μg/mL时，炎症消退率达到46.51%；而在高、中、低三个剂量组中，MYMFB的炎症消退率只在2000 μg/mL时略逊于同NOAEL水平的三金片（46.51%），明显高于MYMFA（27.91%）与High Strength Cranberry（30.23%）；MYMFC样品在各个给药浓度均呈现出比同NOAEL水平的三金片更好的炎症消退效果，当给药剂量为2000 μg/mL时炎症消退率更是达到了51.16%。目前，多个研究已表明原花青素中的各种成分均具有较好的抗炎作用。Wang等[21]证明了原花青素A2可通过靶向核因子-κB、丝裂原活化蛋白激酶和NF-E2相关因子2通路抑制LPS诱导的炎症和氧化应激。Tian等[22]的研究证明了原花青素B2可通过激活PPARγ调节巨噬细胞M2极化从而发挥其抗炎症作用。在本文中，MYMFC由于具有最高含量的原花青素含量，故具有最为优秀的炎症消退能力，与已有的研究结果相符。而MYMFB虽然在抑菌方面表现一般，但却具有三金片相仿的炎症消退能力，其原因可能同样归结于原花青素。与MYMFA相比，MYMFB添加了蔓越莓原果压榨后的果渣，有研究表明，原花青素与细胞壁多糖结合后可大大减缓其降解速率[23]，也正是因此，MYMFB的抗炎能力与MYMFA相比有了及其明显的提高。

3 结论

3.1 本研究通过使用不同浓度的三金片和四种蔓越莓制品对4 dpf的斑马鱼进行给药，并将其培养至5 dpf。在此过程中，给予斑马鱼1500和2000 μg/mL三金片后出现死亡现象，而被给予蔓越莓制品的斑马鱼活力正常，未出现死亡现象，表明三金片具有毒副作用，而蔓越莓制品相比于三金片，具有极高的安全性。3.2 此外相比于模型对照组，在经过三金片与4种蔓越莓制品的给药后，P菌毛阳性大肠杆菌感染的斑马鱼体内的大肠杆菌与中性粒细胞荧光均有所减少，表明三金片与四种蔓越莓制品均具有显著的抑菌与炎症抑制作用（***p＜0.001）。其中原花青素含量最高的MYMFC的抑菌率和炎症消退率最高，高于三金片和市售的High Strength Cranberry产品，表现出极佳的抗炎抑菌能力。相比于MYMFA，添加了原果的MYMFB明显具有更好的抗炎抑菌活性，这可能得益于原花青素与蔓越莓原果细胞壁的结合，这种结合延缓了原花青素的降解。

3.3 综上所述，蔓越莓制品具有良好的抗炎抑菌活性，且原花青素可能在其中起到了关键性作用，但具体机制仍需更深入的研究。