人白细胞抗原-G基因多态性与精神分裂症遗传易感性的相关性

于小佳，朱明武，董 航，程 睿，刘思辰，张守亮，姜 峰，张晨光

(1.新乡医学院第三附属医院耳鼻喉科，河南 新乡 453003；2.新乡医学院医学检验学院，河南 新乡 453003；3.新乡医学院第二附属医院检验科，河南 新乡 453002)

精神分裂症(schizophrenia，SCZ)是一种慢性疾病，临床表现为感知、思维、情感和行为障碍等，严重影响患者及其家人的生活质量[1]。SCZ与遗传高度相关，免疫失调[2-3]、产前母体病毒感染[4]等因素也会增加SCZ的发病风险。全基因组关联研究(genome-wide association studies，GWAS)和连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD)分析发现，染色体6p21-24区域的人类主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)包含一些SCZ易感基因，而人白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA) 6p21.3位于此区域，因此HLA被认为是SCZ易感的重要候选基因[5-6]。HLA-G是一种非经典的MHC-Ⅰb类分子，具有有限的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)和组织分布限制性，通常高表达在妊娠期胚胎的羊水细胞、母胎界面绒毛外滋养层细胞上；但在病理条件下，HLA-G可与免疫细胞上的抑制性受体结合，发挥免疫耐受作用，诱发肿瘤细胞免疫逃逸[7-8]。为了深入探究HLA-G基因SNP与SCZ遗传易感的相关性，本课题采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)和Sanger测序技术，研究河南汉族SCZ患者HLA-G基因外显子2、4、8多态性，以期发现有临床意义的多态性位点，为辅助临床诊治SCZ提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2015年9月至2017年5月新乡医学院第二附属医院收治的SCZ患者353例为SCZ组，患者均符合《精神疾病诊断统计手册(第5版)》关于SCZ的诊断标准[9]。另选择同期健康体检者362例作为对照组(均无精神类疾病家族史)。SCZ组：男181例，女172例；年龄15～46(36.82±13.55)岁；对照组：男188例，女174例；年龄18～53(35.01±13.03)岁。2组受试者的年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究得到医院伦理委员会的批准，所有患者或家属签署书面知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器外周血基因组提取试剂盒和PCR扩增相关试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司，PCR扩增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Eppendorf 5810R大容量高速冷冻离心机购自德国艾本德公司，梯度C1000 Touch PCR仪、PCR扩增仪C1000购自美国Bio-Rad公司，Tanon 3500全自动数码凝胶成像分析系统购自上海天能科技有限公司，DYY-6G核酸胶电泳仪购自北京市六一仪器厂。

1.3 HLA-G基因扩增及测序方法采集所有受试者EDTA-K2抗凝全血2 mL，按试剂盒说明书提取基因组DNA，通过PCR技术扩增HLA-G外显子2、4、8(E2、E4、E8)的基因片段，反应体系均为25 μL，包括12.50 μL 2×Pfu PCR Master Mix、0.25 μg DNA，上下游引物(0.40 μmol·L-1)各1.00 μL，用去离子水补充反应体系至25 μL。E2:正向引物序列为5′-GGGTCGGGCGGGGTCTCAA-3′，反向引物序列为5′-TCCGTGGGGGCATGGAGGT-3′，扩增产物长度361 bp；E4：正向引物序列为5′-CCATGAGAGATGCAAAGTGCT-3′，反向引物序列为5′-TGCTTTCCCTAACAGACATGAT-3′，扩增产物长度364 bp；E8：正向引物序列为5′-GTGATGGGCTGTTTAAAGTGTCACC-3′，反向引物序列为5′-GGAAGGAATGCAGTTCAGCATGA-3′，扩增产物长度210 bp或224 bp。扩增条件为：(1)外显子E2：预变性94 ℃ 5 min，94 ℃变性30 s、64 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，35个循环，最后再72 ℃延伸 5 min；(2)外显子E4：预变性94 ℃ 5 min，94 ℃变性30 s、62 ℃退火 30 s、72 ℃延伸2 min，35个循环，最后再72 ℃延伸5 min；(3)外显子E8：预变性94 ℃ 5 min，94 ℃变性30 s、58 ℃退火 30 s、72 ℃延伸2 min，35个循环，最后再72 ℃延伸 5 min。外显子E2、E4的扩增产物由北京金唯智公司进行Sanger测序，其测序引物分别为：5′-GGGCATGGAGGGGTGGGGGTCGTGAT-3′和5′-CCATGAGAGATGCAAAGTGCT-3′。外显子E8有14 bp 插入/缺失(insert/deletion，I/D)多态性，其扩增产物可以直接通过琼脂糖凝胶电泳分析，无需经过测序分析。

1.4 统计学处理应用DNA star V7.0软件对相应的SNPs 位点进行分析。使用SHEsis在线软件(http://analysis.bio-x.cn/SHEsisMain.htm)直接计算HLA-G基因的基因型和等位基因频率，检验Hardy-Weinberg(H-W)平衡，并对符合H-W平衡的SNP位点进行LD和单倍型分析(D′和r2值)。应用SPSS 22.0软件对多重遗传模型(加性、显性、隐性、超显性、共显性)进行logistic回归分析，通过优势比(odd ratio，OR)值、95%置信区间(confidence interval，CI)评估SCZ的遗传易感风险；计数资料(如基因型、等位基因、单倍型和性别等)以例数和百分率表示，组间比较采用χ2检验，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HLA-G基因SNP的基因型和等位基因频率比较结果见表1和表2。在扩增的3个HLA-G片段中，共观察到7个SNP位点，分别是E2及其侧冀的rs1628628(+188C/T)、rs9258495(+324G/T)、rs41551813(+292A/T)、rs1130355(+372A/G)，E4中的rs12722482(+1799C/T)、rs749449002(+1811A/G)，以及E8中的rs371194629 [14bp (D/I)]。SCZ组和对照组受试者7个HLA-G SNP基因型频率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。除rs9258495外，其余6个位点的基因型分布均符合H-W平衡。

表1 SCZ组和对照组受试者HLA-G SNP的基因型频率比较

表2 SCZ组和对照组受试者HLA-G SNP的等位基因频率比较

在7个HLA-G SNP位点中，rs1628628、rs1130355和rs371194629的最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)均大于0.05，SCZ组rs1628628(+188C/T)的T等位基因频率显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；其余各位点等位基因频率2组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2 不同遗传模式下HLA-G SNP与SCZ的关联性结果见表3。将MAF>0.05的rs1628628、rs1130355、rs371194629多态性位点，以年龄和性别为因变量，在不同遗传模式下HLA-G SNP与SCZ发生风险进行相关性分析，结果发现，rs1628628(+188C/T)的T等位基因通过加性模型(P=0.023，OR=1.275，95%CI 1.035～1.571)、显性模型(P=0.024，OR=1.468，95%CI 1.053～2.048)和共显性模型(P=0.025，OR=1.613，95%CI 1.062～2.451)增加SCZ的发病风险。

表3 不同遗传模式下HLA-G SNPs与SCZ的易感关联性

2.3 HLA-G基因的LD及单倍型与SCZ的遗传易感性关系结果见图1和表4。符合H-W平衡的6个HLA-G SNP位点中，rs1628628(+188C/T)和rs1130355(+372A/G)具有相对较强的LD(D′=0.943，r2=0.612)。

注：A:D′;B:r2；方框中的数值表示百分比，方框中颜色加深表示LD程度加强；A图中的空框表示D′=1(100%)。

表4 HLA-G单倍型与SCZ的遗传易感相关性

HLA-G单倍型与SCZ存在显著相关性(χ2=22.790，P=0.012)。SCZ组与对照组受试者单倍型CAGCAI和TAGCAD的分布频率比较差异有统计学意义(P<0.05)。单倍型TAGCAD显著增加SCZ的发病风险(P=0.009，OR=8.834，95%CI 1.218～64.064)，单倍型CAGCAI可显著降低SCZ的发病风险(P=0.002，OR=0.414，95%CI 0.234～0.734)。

3 讨论

SCZ是一种具有生物学异质性的神经精神疾病，其诱发因素尚不明确，但是近年来个体的神经发育过程、谷氨酸调节和免疫系统差异激活，以及基因变体之间的相互作用、表观遗传学标记、基因表达调控等复杂的分子遗传机制引起了科研工作者的广泛关注，科研工作者普遍认为SCZ是由遗传、生物和环境等因素相互作用的结果[2-4,10]。GANGADIN等[2]研究发现，SCZ的早期阶段存在着免疫失调的迹象，随着疾病的进展，出现白质、髓鞘和灰质减少等神经退行性变。黏膜微生物群可以通过改变人体免疫系统的功能来改变患者的行为和影响认知[10]。上述研究充分说明，遗传因素[5-6]、免疫激活或免疫失调[2-4,10]等均可导致SCZ的发病。有研究发现，感染、自身免疫性疾病和过敏性疾病可增加SCZ的发病风险，免疫系统最重要的HLA区域与SCZ存在着显著的遗传关联性[3-5]。GWAS和LD分析也显示，HLA区带包含一些SCZ易感基因[5-6]。HLA-G是一种非经典的HLA-Ⅰb类分子，可以与细胞表面的特异性抑制性受体结合，发挥免疫抑制特性，有效地抑制CD4+T细胞增殖，抑制自然杀伤细胞、CD8+T细胞的杀伤功能，在调节机体固有免疫反应和获得性免疫反应中发挥着至关重要的作用[8,11]。HLA-G蛋白在胚胎发育中也发挥着重要作用，其基因SNP变异和异常表达与先兆子痫、炎症和自身免疫性疾病相关，提示HLA-G可通过孕妇产前免疫激活赋予家庭后代SCZ患病风险[4,7]。因此，本研究通过PCR和测序技术检测了SCZ患者的HLA-G基因部分编码区及mRNA的3′端非翻译区14 bp多态性，以期寻找与SCZ关联的HLA-G SNP位点，在所扩增的外显子E2、E4和E8区段共发现了7个HLA-G SNP位点，除rs9258495外，其他6个位点均符合H-W平衡。本研究结果发现，7个HLA-G多态性位点中仅rs1628628与SCZ有关联，其T等位基因频率明显高于对照组，提示+188C/T的T等位基因可增加SCZ的易感风险，C等位基因对SCZ疾病的发生具有一定的保护作用，SCZ患者基因型TT在加性、显性和共显性遗传模式中均占优势。由于+188C/T位点位于第1内含子区，不影响HLA-G基因的翻译和蛋白质的表达，此位点多态性影响SCZ疾病的临床价值有限。本研究对6个符合H-W平衡的SNP位点进行了LD估计和单倍型分析，结果发现，rs1628628(+188C/T)和rs1130355(+372A/G)之间有相对较强的LD，2种单倍型与SCZ显著相关，其中单倍型CAGCAI对人群发生SCZ有保护作用，单倍型TAGCAD人群易患SCZ。

综上所述，SCZ患者的+188C/T多态位点的基因型和等位基因均与健康人群存在着差异，尤其是T等位基因频率和包括+188T在内的单倍型频率在SCZ患者中占优势，提示HLA-G的+188C/T与SCZ的易感性有关。由于+188C/T多态位点处于非编码区，并不影响HLA-G蛋白的表达，HLA-G蛋白是否免疫调控SCZ发病过程，还有待进一步探究。后期将增加SCZ患者HLA-G SNP位点的检测，结合膜型HLA-G和分泌型HLA-G等指标进一步评价HLA-G免疫调节SCZ病情进展过程。