三种植物的醇提取物对丁香假单胞菌猕猴桃变种的抑制效果

李欣燃 朱 淼 杨友联 廖 雯 张晓勇 李树江 翁贵英 王绪英

（六盘水师范学院生物科学与技术学院，贵州 六盘水 553001）

丁香假单胞菌猕猴桃变种 （Pseudomonas syringae var. kiwifruit）作为猕猴桃主要病原菌之一[1]，极易引发严重的农业经济损失[2]。如何有效地对该病原菌进行绿色防控，对猕猴桃产业发展极为重要。

研究表明， 核桃青皮[3-7]和蕺菜（Houttuynia cordata Thunb， 又名鱼腥草）[8-10]对多种病原微生物具有不同程度的抑菌效果， 而狭萼鬼吹箫（Leycesteria formosa Wall. var. stenosepala Rehd）作为忍冬科（Caprifoliaceae）鬼吹箫属（Leycesteria）植物变种[11]，尚未见其抗菌作用的相关报道。 本研究首次检测以上三种植物的不同浓度乙醇提取物对丁香假单胞菌猕猴桃变种的抑菌效果， 以期为进一步开发新的植源抗菌剂以及为猕猴桃溃疡病的防治提供参考依据和基础。

1 实验材料与仪器

1.1 实验药品及材料

1.1.1 实验药品

酵母提取物（红润宝顺）；胰化蛋白胨（源叶生物）；氯化钠（国药集团化学试剂有限公司）；NaOH（国药集团化学试剂有限公司）；无水乙醇（天津富宇）；二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

1.1.2 实验材料

核桃采于贵州省毕节市大方县， 经过脱皮处理后获得外层核桃青皮； 蕺菜采自贵州省六盘水市钟山区，取地下茎部分；狭萼鬼吹箫采自贵州省水城区保华镇，取全草待用，以上三种植物海拔均在1 400~1 900m 之间。

丁香假单胞菌猕猴桃变种保存于六盘水师范学院生物科学与技术学院实验中心微生物学实验室，菌种活化及后续培养温度为37℃。

1.2 实验仪器

紫外可见分光光度计 （北京东西分析仪器有限公司，UV-2100 型）；全自动高压灭菌锅（日本三洋（SANYO），MLS-3750）；恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司，HH-2 型）；超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司，SB-800DT 型）；烘箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂，BGZ 系列II 型）；自动脱帽离心机（湖南赫西仪器装备有限公司，TD5 脱帽型）；电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司，JA4103）；恒温培养箱（上海琅玕实验设备有限公司，DHP-9270B）； 全温振荡培养箱（常州普天仪器制造有限公司，HZQ-F400）； 无菌操作台 （苏州安泰空气技术有限公司，SW-CJ-2FD）；电子分析天平（岛津企业管理（中国）有限公司，ATY124 型）。

2 实验方法

2.1 材料处理

将当年采摘的新鲜核桃外侧青色果皮 （即核桃青皮）、蕺菜地下茎、狭萼鬼吹箫全草放置于空旷阴凉处风干，并于40℃烘箱内恒温烘干至恒重，用粉碎机将其粉碎成粉末状， 过40 目筛收集后，密封冷藏保存备用。

2.2 提取物浸膏获取

分别准确称取三种处理后的材料5 g 各6 份置于250 mL 锥形瓶内， 依次加入蒸馏水、20%乙醇溶液、40%乙醇溶液、60%乙醇溶液、80%乙醇溶液和无水乙醇， 轻轻摇动锥形瓶混匀后， 放置在800 W 功率条件下超声 50 min，5 000 rpm/min 离心3 min 取上清，40℃恒温水浴蒸干形成浸膏并称重。 所得浸膏用5mL 二甲基亚砜进行溶解后于4℃保存[12]。

2.3 得率计算

水溶液和不同浓度乙醇溶液提取物的得率用下列公式计算[13]：

其中，M 为含有浸膏的烧杯质量 （g），m 为烧杯质量（g），5 为所取材料 5 g。

2.4 抑菌效果检测

将丁香假单胞菌猕猴桃变种在37℃条件下进行活化， 在无菌超净台中用Luria-Bertani 培养基（LB）培养基进行稀释，并以液体LB 培养基为标准对照，利用紫外可见分光光度计在600 nm 处测量菌液光密度值至菌液吸光度为0.5 为止。取稀释后的菌液60 ul 加入到无菌平板内用涂布棒涂抹均匀， 使用玻璃棒在铺好菌液的平板中打出规则圆孔后，加入40 ul 植物提取液[14]。 用封口膜将平板封好， 放置37℃恒温培养16 h 后取出后观察，并采用十字交叉法测量抑菌圈大小[15]。

3 结果及分析

3.1 三种植物乙醇提取物得率

三种植物的浸膏提取质量及得率详见表2。 从表2 可知，核桃青皮用80%乙醇为提取剂时浸膏得率最高，蕺菜用40%乙醇为提取剂时浸膏得率最高，狭萼鬼吹箫用80%乙醇为提取剂时浸膏得率最高。

表2 三种植物的浸膏的质量（g）及得率（%）Table 2 Quality (g) and yield (%) of extracts of three plants

3.2 三种植物提取物对丁香假单胞菌猕猴桃变种的抑制作用

采用打孔法分析三种植物的水提物和不同浓度乙醇提取物对该病原菌的抑制，结果详见图1（a-c）。

上述数据提示DAAs治疗CHC疗效确切，对于DAAs治疗失败患者可使用SOF/VEL/VOX进行挽救治疗，然而基因3型、肝硬化程度重及存在NS5A RAS再治疗的应答率相对较低。

图1 三种植物提取物对丁香假单胞菌猕猴桃变种的抑制作用图1 Figure 1 Inhibitory effects of three plant extracts on P.syringae var.kiwifruit.

核桃青皮提取物抑菌圈直径详见表3。 由表3 可知，在各稀释倍数乙醇提取物原液中，其抑菌圈均超过20 mm，说明核桃青皮对丁香假单胞菌猕猴桃变种具有较强的抑制作用，其中60%乙醇提物具有最大的抑菌圈，其直径为32.3 mm；无水乙醇提取物的抑菌圈直径最小， 为22.6 mm。 同时，随着提取液稀释倍数的增加，抑菌圈的直径逐渐减小，而各浓度中，60%乙醇提物均具有最大的抑菌圈直径，充分说明了此浓度乙醇的提取物中含有对丁香假单胞菌猕猴桃变种抑制性较强的化合物，可进一步对其进行分离纯化。

表3 核桃青皮提取物对丁香假单胞菌猕猴桃变种抑菌圈直径（mm）Table 3 Diameter of bacteriostatic circle of walnut green husk extract against P.syringae var.kiwifruit(mm)

蕺菜提取物抑菌圈直径详见表4。 由表4 可见，在各稀释倍数溶剂提取物原液中，80%乙醇提取物原液具有最大抑菌圈，直径为20.5 mm，而水提物的抑菌圈直径最小为12.4 mm。 结果表明蕺菜80%醇提物对丁香假单胞菌猕猴桃变种的抑制作用最强，其水提物的抑制性最弱。 当提取物原液8 倍稀释后，低浓度的醇提物和水提物抑菌作用消失。

表4 蕺菜提取物对丁香假单胞菌猕猴桃变种抑菌圈直径（mm）Table 4 Diameter of bacteriostatic circle of Houttuynia cordata Thunb.extract against P.syringae var.kiwifruit(mm)

狭萼鬼吹箫提取物抑菌圈直径详见表5，各稀释倍数溶剂提取物原液对丁香假单胞菌猕猴桃变种都有抑菌作用，其60%醇提物和40%醇提物抑菌圈直径最大， 分别为21.3mm 和21.4mm，当提取物原液8 倍稀释后，低浓度的醇提物和水提物抑菌作用消失。

表5 狭萼鬼吹箫提取物对丁香假单胞菌猕猴桃变种抑菌圈直径（mm）Table 4 Diameter of bacteriostatic circle of Leycesteria formosa var.stenosepala Rehd.extract against P.syringae var.kiwifruit(mm)

4 讨论与结论

丁香假单胞菌猕猴桃变种是猕猴桃溃疡病的主要病原菌之一，已给农业生产造成严重的经济损失，目前农业上主要应用化学制剂进行杀菌处理， 长期采用该处理方式容易导致耐药菌产生，同时对猕猴桃的产量和品质造成损害，不利于该产业的长期健康发展[16-17]，开发一种绿色安全有效的生物制剂控制该病原菌将为猕猴桃产业发展带来良好的经济效益。

植物体内含有丰富的生物活性物质[18-19]，其成分较复杂，常用的天然植物有效成分提取试剂有乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等，各成分间极性存在一定差异， 采用不同溶剂进行提取时，其提取物的种类和含量会有所不同，且不同提取物之间生物活性也会存在一定差异[20-21]。 由于试验的最终目的是应用于农产品绿色防控方面，故仅采用无毒无残留乙醇作为提取试剂考察三种植物的抑菌效果。

本实验结果表明，采用80%乙醇提取核桃青皮时，其浸膏得率最高，为24.04%；采用40%乙醇提取蕺菜时，其浸膏得率最高，为25.08%；采用80%乙醇提取狭萼鬼吹箫时，其浸膏得率最高，为12.96%。 抑菌实验结果表明，60%核桃青皮、80%蕺菜、40%或60%狭萼鬼吹箫乙醇提取液具有最佳的抑菌效果。 可见，抑菌效果与浸膏得率间相关性较小，而与植物不同极性中所含有的化合物相关。

此外，大量研究已发现核桃青皮和蕺菜对多种病原菌具有抑制作用[22-23]，通过查阅中外文献和书籍，笔者未发现关于狭萼鬼吹箫抑菌效果方面的报道，本研究首次发现该植物对丁香假单胞菌猕猴桃变种具有一定的抑制作用，且值得注意的是狭萼鬼吹箫乙醇提取物的最佳抑菌效果优于蕺菜，未来可对该植物具体抑菌成分进一步深入研究。本试验补充了狭萼鬼吹箫在抑菌效果方面的相关研究，为其在该领域的开发利用提供参考。

结论：三种植物浸提物对猕猴桃变种抑菌效果为：核桃青皮提取物＞狭萼鬼吹箫提取物＞蕺菜提取物。 核桃青皮乙醇提取物的抑菌效果优于其他两种植物，可作为丁香假单胞菌猕猴桃变种最佳的植源抗菌剂候选材料之一。