基于NF-κB/COX-2信号通路探讨芍药内酯苷对溃疡性结肠炎模型大鼠的影响*

黄梅，颜景颖

1.南方科技大学医院，广东 深圳 550002；2.北京中医药大学深圳医院，广东 深圳 518111

溃疡性结肠炎是一种肠道非特异性慢性炎症性疾病，主要表现为腹泻、腹痛、便血等并伴随着消瘦、发热等症状[1]。我国溃疡性结肠炎的发病率逐年上升[2]。由于溃疡性结肠炎易反复发作，久治难愈，甚至需终生服药的特点，使患者生活质量严重下降。溃疡性结肠炎常用治疗药物有氨基水杨酸制剂、抗生素、免疫抑制剂等，由于部分患者服用此类药物仍存在病情反复发作，不易控制等情况[3]。因此，寻找新的药物尤为重要。芍药内酯苷是白芍提取物之一，具有抗菌消炎、护肝等作用。研究表明，芍药汤对大鼠溃疡性结肠炎有一定的药效作用[4]。核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)/环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)信号通路在肠道炎症过程中发挥重要作用[5]。因此，本研究旨在分析芍药内酯苷通过调控NF-κB/COX-2信号通路对溃疡性结肠炎模型大鼠的影响，为芍药内酯苷的临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 动物60只8周龄SPF级SD雄鼠，体质量210～230 g，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(沪)2018-0006，温度 22～25 ℃，相对湿度40%～60%，光照和黑暗各12 h，自由进食标准饲料和饮水。伦理批号：SUSTH20190302。

1.2 药物与试剂芍药内酯苷(纯度≥98%，南京道斯夫生物科技有限公司，批号：190412)；美沙拉嗪肠溶片(德国福克制药股份有限公司，批号：H201207)。三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitro-Benzenesulfonic acid，TNBS)溶液(美国Sigma公司，批号：1904182)；白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(武汉云克隆诊断试剂研究所有限公司，批号：R201905、R201903)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒(上海卡努生物科技有限公司，批号：190410A)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测试盒(北京百奥莱博科技有限公司，批号：201906C)；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒(上海康朗生物科技有限公司，批号：201904136、201902115)；实时定量聚合酶链式反应(real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)荧光染料预混剂(北京康为世纪生物科技有限公司，货号：PCR106321)；苏木素-伊红(hematoxylin eosin，HE)染色试剂盒(上海羽朵生物科技有限公司，批号：190407004)；引物合成委托北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；NF-κB、COX-2、p-NF-κB、β-actin兔单克隆抗体和山羊抗兔辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)二抗(美国Abcam公司，批号：201905148、201906037、201906024、201907235、201908241)。

1.3 仪器H2100R型高速冷冻离心机(上海湘仪离心机仪器有限公司)；Evolution350型紫外分光光度计(美国Thermo公司)；HTY-761型匀浆仪(浙江泰林生物技术股份有限公司)；LightCycler 96型 RT-qPCR仪(瑞士罗氏公司)；Tetra Cell制胶系统、转膜仪(美国Bio-Rad公司)；LAUDA型摇床(德国Varioshake公司)；BIOBASE-EL10A型酶标仪(山东博科生物产业有限公司)；XSP-19C型光学显微镜(上海上光仪器有限公司)；YGQ-3126F型切片机、YT-7F型摊烤片机(孝感市亚光医用电子技术有限公司)。

2 方法

2.1 模型制备与给药60只SD雄鼠，随机选取10只为假手术组，其余大鼠使用TNBS/乙醇混合液灌肠法建立溃疡性结肠炎模型，具体如下：大鼠禁食不禁水 24 h，TNBS(80 mg·kg-1)与体积分数50%无水乙醇按11混合。将大鼠麻醉后，使用硅胶软管(直径2 mm)插入大鼠肛门约8 cm深度，将 800 μL TNBS/乙醇混合液推入肠腔，倒置大鼠30 s，防止混合液外漏，待自然清醒后，正常饲养。假手术组大鼠麻醉后向肠腔内注射800 μL生理盐水。3 d后，随机挑取3只建模大鼠，取结肠组织经过HE染色观察结肠病变，出现出血、水肿、溃疡即为建模成功。将建模成功的大鼠随机分为5组，即模型组、美沙拉嗪组(0.36 g·kg-1)、芍药内酯苷高剂量组(60 mg·kg-1)、芍药内酯苷中剂量组(30 mg·kg-1)、芍药内酯苷低剂量组(15 mg·kg-1)，各组给予相应药物14 d；假手术组和模型组均灌胃同体积生理盐水，每日1次，连续14 d。在造模期间死亡1只大鼠，然后分为假手术组10只、模型组9只、美沙拉嗪组9只、芍药内酯苷高剂量组10只、芍药内酯苷中剂量组9只，芍药内酯苷低剂量组9只。

2.2 ELISA法检测大鼠血清促炎因子水平给药结束后，将大鼠麻醉，辅助动脉取血，室温静置2 h，3 000×g离心20 min，取上层清液即为血清，通过ELISA试剂盒检测大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平。

2.3 检测大鼠结肠组织抗氧化指标取血后，将大鼠颈椎脱臼法处死后，取出结肠，每只取同部位少许结肠，加生理盐水，制备结肠组织匀浆。硫代巴比妥酸反应法检测大鼠结肠组织中MDA活性；黄嘌呤氧化酶法检测大鼠结肠组织中SOD活性。

2.4 HE染色观察大鼠结肠组织病变每组随机选取3只大鼠，取结肠组织置于40 ng·L-1多聚甲醛中固定过夜后，石蜡包埋，切片厚度为5 μm，经过脱蜡、复水后按照HE染色试剂盒说明书进行切片HE染色，在显微镜下观察其病理损伤变化。

2.5 RT-qPCR法检测大鼠结肠组织NF-κBmRNA、COX-2mRNA水平每组随机选取3只大鼠，取结肠组织，加入液氮研磨匀浆后，用RNA提取试剂盒提取组织中总RNA，然后再用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。NF-κB上游引物：5′-TAAGCATCGATTCCAGTAGAC-3′，下游引物：5′-TGATGCCATGCACTACGATA-3′，产物长度121 bp；COX-2上游引物：5′-CAGCTAGCCACATGATTCAC-3′，下游引物：5′-ATCTACAGATTCAGGATCGAT-3′，产物长度137 bp；β-actin上游引物：ATCTGACCGATACAGCATACG-3′，下游引物：5′-CTAGCTAGGCTAGCCCATAGA-3′，产物长度115 bp。设置反应程序：解链温度95 ℃ 30 s，退火温度56 ℃ 30 s，延伸温度72 ℃ 30 s，35个循环。使用配套荧光采集系统分析各样本Ct值，计算出目的基因mRNA的相对表达量。

2.6 Western Blot法检测大鼠结肠组织NF-κB、COX-2及p-NF-κB蛋白表达每组随机3只大鼠，取结肠组织，加入适量液氮研磨匀浆后，加入细胞裂解液，4 ℃裂解过夜后，10 000×g离心 10 min，上清即为组织总蛋白，将蛋白上样、电泳、转膜后，加入体积分数5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入一抗4 ℃过夜，TBST缓冲液洗3次，更换二抗室温孵育2 h，TBST洗3次，显色。使用图像分析软件对条带灰度值进行分析，并以β-actin为内参计算出目的蛋白表达量。

3 结果

3.1 芍药内酯苷对大鼠血清促炎因子水平的影响与假手术组比较，模型组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平极显著升高(P<0.01)；与模型组比较，芍药内酯苷高剂量组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平极显著降低(P<0.01)，芍药内酯苷中、低剂量组及美沙拉嗪组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平比较

3.2 芍药内酯苷对大鼠结肠抗氧化指标活性的影响与假手术组比较，模型组大鼠结肠组织MDA活性显著升高(P<0.05)，SOD活性显著降低(P<0.05)；与模型组比较，芍药内酯苷高、中、低剂量组及美沙拉嗪组大鼠结肠组织MDA活性显著降低(P<0.05)，SOD活性显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠结肠MDA、SOD活性比较

3.3 芍药内酯苷对大鼠结肠组织病理学变化的影响假手术组大鼠结肠各层结构清晰，腺体排列整齐，无炎性细胞浸润；模型组大鼠结肠黏膜多处溃烂、坏死，腺体排列紊乱，炎性细胞浸润严重；芍药内酯苷高剂量组结肠黏膜结构基本完整，腺体排列整齐，少量炎性细胞浸润；美沙拉嗪组和芍药内酯苷中剂量组大鼠结肠黏膜上皮较完整，腺体排列较整齐，有少量炎性浸润；芍药内酯苷低剂量组大鼠结肠黏膜充血水肿偶见溃疡，腺体排列稀疏且不规整，炎性细胞浸润减轻。见图1。

3.4 芍药内酯苷对大鼠结肠组织NF-κBmRNA、COX-2mRNA水平的影响与假手术组比较，模型组大鼠结肠组织NF-κBmRNA、COX-2mRNA水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，芍药内酯苷高、中、低剂量组及美沙拉嗪组大鼠大鼠结肠组织NF-κBmRNA、COX-2mRNA水平显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠结肠组织NF-κB mRNA、COX-2 mRNA表达比较

3.5 芍药内酯苷对大鼠结肠组织NF-κB、COX-2及p-NF-κB蛋白表达的影响与假手术组比较，模型组大鼠结肠组织p-NF-κB/NF-κB水平及COX-2蛋白表达显著升高(P<0.05)；与模型组比较，芍药内酯苷高、中、低剂量组及美沙拉嗪组大鼠结肠组织p-NF-κB/NF-κB水平及COX-2蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图2、表4。

图2 大鼠结肠组织NF-κB、COX-2蛋白及p-NF-κB表达

表4 各组大鼠结肠组织NF-κB、COX-2及p-NF-κB蛋白表达比较

4 讨论

溃疡性结肠炎的发病机制尚未明确，遗传、免疫低下、肠道微生态失衡等均是其致病因素[6-7]。多种因素相互作用引起机体免疫反应被激活，炎性因子释放，造成肠道发生持续性炎症，严重影响肠道的功能，损坏肠道黏膜屏障[8-9]，使得细胞通透性增加，导致肠黏膜遭受细菌、内毒素等侵害，发生糜烂、溃疡等[10]。中医学认为，溃疡性结肠炎主要由大肠湿热、肝血亏虚所致，治疗以补虚泻实、清热利湿、理气导滞为主[11-12]。芍药具有清热凉血、补血柔肝、散瘀止痛等功效[13-14]，芍药内酯苷是其主要的有效成分之一，研究芍药内酯苷对溃疡性结肠炎的治疗效果具有重要临床意义。

IL-1β是引起溃疡性结肠炎的促炎因子之一，可促使炎性细胞进入炎症部位，活化淋巴细胞等作用[15]。研究表明，溃疡性结肠炎患者在溃疡活动期结肠中IL-1β水平升高[16]。IL-1β已作为临床判断溃疡结肠炎的溃疡程度与疗效的重要指标之一。TNF-α是一种重要的促炎因子，已证实与溃疡性结肠癌发病有关[17]。正常生理状态下，TNF-α具有抗感染、促进组织修复等作用，在病理状态下，会刺激机体局部组织发生炎症反应[18-19]。研究报道，TNF-α可改变肠道黏膜通透性，导致肠道损伤，且随着肠道损伤程度加重，TNF-α水平也随之升高[20]。本研究结果显示，与模型组比较，芍药内酯苷组大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平显著降低，提示芍药内酯苷可以抑制炎症反应。

研究表明，溃疡性结肠炎局部炎症反应与氧自由基密切相关，机体氧自由基可激活或者充当炎性介质，引起结肠组织发生炎症反应[21]。研究发现，发生氧化应激时，氧自由基可与不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，脂质过氧化产物可被机体代谢分解为MDA，MDA可使组织中蛋白质变性、生物膜结构受损，引起促炎因子释放，导致组织损伤加重[22]。SOD为抗氧化酶，可清除氧自由基，抑制组织中脂质过氧化反应。研究表明，溃疡性结肠炎患者血清、肠黏膜中MDA升高而SOD降低[23]。本研究结果发现，与模型组比较，芍药内酯苷高、中、低剂量组及美沙拉嗪组大鼠结肠组织MDA活性显著降低，SOD活性显著升高。

NF-κB通路与炎症反应关系密切，当机体发生炎性反应时，促炎因子IL-1β、TNF-α等可激活NF-κB，使其发生磷酸化，激活 NF-κB 通路，促使IL-1β、TNF-α的进一步表达，发生炎症反应[24-26]。研究表明，溃疡性结肠炎结肠病变组织NF-κB异常高表达[27]。COX-2在正常组织中表达极低，在炎症、肿瘤等病理状态下其表达显著增加[28]。COX-2可使炎症细胞产生大量前列腺素E2、白三烯等炎症介导物质，导致炎症部位出现红、肿、热、痛，从而加重肠道溃疡[29-30]。本研究结果显示，模型组比较，芍药内酯苷高、中、低剂量组及美沙拉嗪组大鼠结肠组织p-NF-κB/NF-κB水平及COX-2蛋白表达显著降低，提示芍药内酯苷对溃疡性结肠炎的治疗作用可能与NF-κB/COX-2信号通路有关。

综上所述，芍药内酯苷可抑制溃疡性结肠炎大鼠的炎症反应，抑制结肠组织过氧化反应，减轻结肠组织病变，作用可能与NF-κB/COX-2信号通路有关。