缩泉润肠方对便秘模型大鼠结肠组织中水通道蛋白的影响*

潘姣，张晓雨，孙光军，2，林爱珍，2

1.湖北中医药大学，湖北 武汉 430061；2.湖北省中医院，湖北 武汉 430061

便秘是一种常见的消化系统疾病，一般表现为排便困难或排便次数减少、粪便质地干硬或伴有排便不尽感[1]。流行病学调查显示，我国成人慢性便秘的患病率为4%～10%[2]，以中老年女性为主。由于本病发病机制复杂、病程持久的特点，严重影响了患者的生活质量。其中刺激性泻药会损害肠道神经，渗透性泻药容易引起电解质代谢紊乱，甚至发生心血管等不良事件[3]。水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一类具有高度选择性的跨膜通道[4]，主要用于调节细胞内和细胞间水流的作用[5]。结肠上皮细胞AQPs表达的失调是便秘的发生的重要因素，Spearman等级相关系数证实粪便含水量与AQPs表达之间存在显著相关性[6]。近年来，中医药治疗便秘具有独特优势，湖北省中医院林爱珍教授以《温病条辨》中增液汤为基础自拟验方缩泉润肠方临床治疗老年功能性便秘疗效显著[7-9]，为证实该验方的通便作用与水通道蛋白的相关性，本实验拟从结肠黏膜水通道蛋白AQP3、AQP8、AQP9进一步探讨缩泉润肠方治疗老年性便秘的作用。

1 材料

1.1 动物24月龄SPF级SD大鼠50只，雌雄各半，体质量(280±20)g，由湖北省疾病预防控制中心提供，合格证号：SCXK-(鄂)2008-0005。所有大鼠单笼单只独立饲养，室内温度保持21～25 ℃、相对湿度保持45%～60%，每10 h通风换气1次，24 h 自由饮水。本动物实验通过湖北中医药大学伦理实验委员会和国家实验动物使用法批准。伦理批号：SYXK2019-0002。

1.2 药物及试剂缩泉润肠方(颗粒剂)：山药、益智仁、生白术、玄参各20 g，火麻仁、当归各15 g，麦冬、乌药、生地各12 g，杏仁10 g等10味中药对应生药量的三九散装免煎颗粒(湖北省中医院药学部)；乳果糖口服溶液(Abbott Healthcare Products B.V.进口药品注册证号：H20120387)；复方地芬诺酯片(河南鼎昌药业有限公司，国药准字：H22022037)；阿拉伯树胶(泰安市利达胶业有限公司,货号：ZY-1033)；苏木素—伊红染色液(北京索来宝生物科技有限公司,货号：G1120)；RNA提取液Trizol(美国Invitrogen公司,货号：15596026)；cDNA Synthesis试剂盒(美国Fermentas公司,货号：K1622)；2×Taq PCR MasterMix试剂盒(北京天根生化科技有限公司,货号：KT201)；50×TAB电泳液(北京索来宝生物科技有限公司,货号：T1060)；琼脂糖(西班牙Biowest Agarose公司,货号：111860)；DEPC水(北京拜尔迪生物技术有限公司,货号：46-000)。

1.3 仪器研钵(郑州华丰化学仪器实验有限公司，规格：60 mm)；高速离心机(北京时代北利离心机有限公司，型号：OTC350)；高速冷冻离心机(上海楚泊实验室设备有限公司，型号：3K15型)；PCR仪(上海比朗仪器有限公司生产，型号：MA-1610)；移液器(瑞士HamiIton公司，型号：Softgrip)；电泳槽(南京瓦森生物科技有限公司，型号：RF602型)；电泳仪(上海俊仕生物科技有限公司，型号：SE-300)；鼓风干燥箱(天津市美特斯试验机厂，型号：101型)；电子天平(德国Sartorius公司，型号：Quintix65-1CN)。

2 方法

2.1 动物造模、分组与给药采用复方地芬诺酯混悬液(100 mg·kg-1)连续灌胃3周建立大鼠便秘模型[10]。将造模成功的大鼠随机分模型组、乳果糖口服液组(0.670 g·kg-1)、缩泉润肠颗粒剂低剂量组(14.04 g·kg-1)、缩泉润肠颗粒剂高剂量组(28.08 g·kg-1)，每组10只，另设10只空白对照组大鼠，连续给予相应的药物2周。观察模型组与空白对照组大鼠的粪便含水量及碳墨推进率判断造模是否成功。按照《中药药理实验方法学》[11]计算大鼠药物灌胃剂量。

2.2 标本处理大鼠禁食不禁水12 h后，灌胃10%活性炭悬液2 mL，30 min后予以颈椎脱臼处死，将腹部切开，取从直肠末端到幽门之间的全部肠道，测定碳墨推进率。并取升结肠组织和降结肠组织各5 cm，予以冰生理盐水冲洗肠腔内容物后，将结肠切开并用载玻片固定在一端，而用另一载玻片轻轻刮下肠系膜，选取部分组织置于冻存管中，并置于-80 ℃液氮中保存。

2.3 观察指标观察各组大鼠的一般情况(进食量、粪便排出粒数、毛发色泽、精神状态及处死后结肠内残留的粪便粒数等)、粪便含水量、碳墨推进率。

粪便含水量=(湿粪质量-干粪质量)/湿粪质量×100%

碳墨推进率=[墨汁推进长度(cm)/小肠总长度(cm)]×100%

2.4 测定大鼠结肠AQP3mRNA、AQP8mRNA、AQP9mRNA表达采用RT-PCR法检测大鼠结肠AQP3mRNA、AQP8mRNA、AQP9mRNA表达[12]：在提取标本中的RNA时严格按照试剂盒说明书执行相关操作，然后在进行逆转录：每组大鼠各取0.5 g结肠组织,匀浆,用Trizol试剂提取总RNA，逆转录成cDNA。PCR反应体系：上下游引物各0.5 μL,5×PCR buffer 10 μL,dNTPs 0.5 μL,Tap酶1 μL,cDNA模板5μL,补加双蒸水至50 μL。扩增条件：50 ℃ 2 min,95 ℃ 5 min,95 ℃15 s,60 ℃ 45 s,共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-△△CT法计算目的mRNA相对表达量。在NCBI基因库中检测出AQP3、AQP8、AQP9的基因序列，然后通过Primer5.0软件来设计它们的各自引物序列，运用并通过NCBI BLAST核对其特异性是否存在；由上海生工生物工程技术服务有限公司合成它们各自引物。引物序列详见表1。

表1 目的基因的引物核苷酸系列

3 实验结果

3.1 大鼠的一般情况比较模型组大鼠进食量及粪便排出粒数均减少，解剖后发现大鼠结肠组织内残留粪便粒数增多；乳果糖口服液组及缩泉润肠颗粒组大鼠精神状态较模型组有好转，进食量及粪便排出粒数均增加，解剖后发现结肠组织内残留粪便粒数减少。

3.2 大鼠肠管炭墨推进率及粪便含水量的变化与空白对照组比较，模型组大鼠结肠碳墨推进率、粪便含水量显著降低(P<0.05)，提示便秘大鼠造模复制成功；与模型组比较，缩泉润肠颗粒低、高剂量组的碳墨推进率及粪便含水量显著增加(P<0.05)，乳果糖口服液组碳墨推进率无明显改善(P>0.05)，粪便含水量显著升高(P<0.05)；与乳果糖口服液组比较，缩泉润肠颗粒低、高剂量组大鼠结肠碳墨推进率及粪便含水量均显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠碳墨推进率及大鼠粪便含水量变化

3.3 各组大鼠结肠组织结构的变化空白对照组大鼠结肠黏膜层光滑，肠腺排列整齐，未见溃疡、糜烂及炎性细胞浸润；模型组大鼠中指状皱襞的边缘不致密，表明屏障缺如不完整，且模型组中黏蛋白明显减少，肠屏障结构受到破坏，结肠黏膜可见少许上皮脱落，并伴有炎性渗出；乳果糖口服液组大鼠结肠黏膜较模型组改善明显；缩泉润肠颗粒组大鼠结肠炎性渗出减少，肠屏障结构明显恢复。见图1。

注：A：空白对照组；B 模型组；C 乳果糖口服液组；D：缩泉润肠颗粒低剂量组；E：缩泉润肠颗粒高剂量组

3.4 对大鼠结肠组织AQP3mRNA、AQP8mRNA、AQP9mRNA水平的影响与空白对照组比较，模型组大鼠结肠组织中AQP3mRNA、AQP8mRNA水平显著升高，AQP9mRNA水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，缩泉润肠颗粒低、高剂量组及乳果糖口服液组大鼠结肠组织AQP3mRNA、AQP8mRNA水平显著下降，AQP9mRNA水平显著升高(P<0.05)；与乳果糖口服液组比较，缩泉润肠颗粒低、高剂量组大鼠结肠组织AQP3mRNA、AQP8mRNA水平显著降低，AQP9mRNA水平显著升高(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠结肠水通道蛋白(AQP3、AQP8、AQP9)mRNA比较

4 讨论

《素问·五脏别论》[13]曰：“夫胃大肠小肠三焦膀胱，此五者，天气之所生也，其气象天，故泻而不藏，此受五脏浊气，名曰传化之府，此不能久留输泻者也。”中医学认为，二便的贮存、排泄与脾、肾、膀胱、大肠密切相关。脾主运化水湿，肾司气化，大肠传导糟粕。一般情况下，体内多余的水液在脾脏和肾脏等脏腑的参与下由膀胱与大肠进行排泄。张仲景提出“利小便实大便”理论指将大肠中多余水湿之邪通过小便排泄体外，达到调节大便的目的。《伤寒论》第159条记载[14]：“伤寒服汤药，下利不止，……复不止者，当利其小便。”肠道水分过多，可通过膀胱转输多余的水液，进而排小便散水湿之邪；若脾失健运、水湿停滞，则大量水液进入膀胱，水液分配失衡以致肠道内津液匮乏则易引起大便秘结不通。由此可知，若肠道水分不足，肠壁干涩失于濡润，可借膀胱之水润滑肠道，助力行舟。故“利小便实大便”理论可引申出“缩小便通大便”之意，通过固摄膀胱，减少膀胱内储存尿液，传输至大肠中改善肠道水生态微环境，增加肠道润滑度，协助排便。

AQPs作为一族特异性孔道，通过介导水液的跨梯度转运，控制水分在细胞的进出，在机体水运系统中发挥重要作用。目前结肠上皮细胞中AQPs表达有13种，从AQP0到AQP12，广泛分布于不同器官和组织的特定细胞类型中[15]。随着便秘的研究深入，发现AQPs中AQP3、AQP8、AQP9参与肠道内水液调控及吸收，与便秘的发生密切相关[16-17]。

AQP3主要分布在结肠黏膜腔面细胞质和细胞基底侧，是结肠中水液运输最重要的功能分子之一，可将肠腔内的水分转运至细胞间隙[18]。AQP3通过影响肠腔内水分多少，与便秘的发生有直接联系。此外，AQP3不仅促使结肠细胞对水分的吸收，也可增强其对尿素和甘油的转运[19]。采用复方地芬诺酯混悬液对小鼠灌胃进行便秘模型的复制，发现模型组小鼠结肠AQP3蛋白表达上调[20]，认为便秘与AQP3表达强弱相关，而增液汤下调模型小鼠结肠AQP3蛋白表达，“增液行舟”可通过增加肠道内水分吸收，从而改善肠腔内分泌环境，促进排便。AQP8、AQP9主要表达于小鼠结肠黏膜上皮细胞和杯状细胞[21]，参与对粪便水分的吸收及肠道黏液的分泌。其中AQP8在腹泻患者结肠中表达降低，在便秘患者结肠中表达明显升高[22]。研究发现，朱氏润肠方能直接减少肠道对水分的重吸收、增加肠液的分泌，其作用机制可能是与通过抑制PI3K/AKT信号通路，下调AQP3和AQP8的蛋白表达，间接增加粪便的含水量，改善慢传输型便秘[23]。研究发现，AQP9在左半结肠能分泌肠腔黏液，且在左半结肠的表达明显高于右半结肠，便秘患者左半结肠AQP9 表达显著降低[24]，表明便秘的机制可能与AQP9的异常表达相关。研究发现，便秘模型大鼠AQP9表达在远端结肠组织中较空白对照组降低[25]，并证实AQP9表达上调可能与刺激结肠水分吸收，影响排便。

缩泉润肠方是林爱珍教授三十年来临证治疗老年肾阳虚型便秘的验方。肾阳虚型便秘患者多表现为大便排出困难、粪质干硬、平素畏寒、夜尿频数。《温病条辨》：“水不足以行舟，而结粪不下……”水匮无力行舟故当增水助力行舟。该方由山药、益智仁、生白术、玄参各20 g，火麻仁、当归各15 g，麦冬、乌药、生地黄各12 g，杏仁10 g组成。以增液汤为基础，加以滋阴润肠通便、温肾固摄之药组合，通过固肾缩泉、养阴生津，以达增液润肠、助力行舟之功效[8]。方中益智仁、山药归脾、肾经，具有温脾摄涎、暖肾固精缩尿的功效。研究证实，益智仁中提取的多糖、7-表-香科酮具有改善胃肠功能的作用[26]。生白术归脾、胃经，功专运脾通便。徐灵胎在《伤寒论类方》[27]描述：“白术生肠胃之津液”。又云白术“富有膏脂，……亦能滋润津液”。研究证实，生白术可通过增加粪便含水量、促进肠道传输功能，进而改善便秘大鼠症状[28]。乌药温肾散寒，止小便频数。火麻仁、当归功专润肠通便，且肺与大肠相表里，佐以杏仁，可增强火麻仁、当归的润滑肠黏膜的作用；玄参、麦冬、生地黄三味中药合用行“增液行舟”之效。诸药合用，共奏“补肾缩泉、增液润燥”之功，则肠腑有节，小便止数，大便得通。缩泉润肠方的创立乃受先人“利小便实大便”思想启发，反其道而行之，运用“缩小便通大便”理念开源助舟、润燥滑肠，治疗老年功能性便秘。正如《医学正传·秘结论》所言：“夫肾主五液，故肾实则津液足，而大便滋润，肾虚则津液竭，而大便燥结”。林师临证运用此法治疗老年肾阳虚型便秘效如桴鼓。

综上所述，缩泉润肠方促进便秘大鼠胃肠动力和调节肠道水液代谢，其机制可能是通过调节AQP3、AQP8、AQP9表达来实现的。从机体津液分布及代谢角度揭示了中医药治疗便秘的机制，为从“利小便实大便”角度调理脏腑功能改善便秘症状提供了实验依据，继承和发展了中医药治疗老年性便秘的理念。