HLA-DQ单核苷酸多态性与婴儿牛奶蛋白过敏的相关性分析

李才学　　余楚烈　　何佳

[摘要] 目的 分析HLA-DQ單核苷酸多态性与婴儿牛奶蛋白过敏（CMPA）的相关性。 方法 回顾性收集杭州市儿童医院2020年1～8月确诊的80例CMPA患儿（CMPA组）和80名健康婴儿（对照组）为研究对象，统计两组基本临床信息;采用实时荧光定量PCR分析HLA-DQ单核苷酸多态性;采用多因素logistic回归分析探讨CMPA的危险因素。 结果 本研究共纳入160例婴儿进行分析，CMPA组婴儿纯母乳喂养时间显著短于对照组，而家族过敏史和HLA-DQA1基因频率显著高于对照组（P<0.05）;多因素logistic回归分析结果显示，有家族过敏史（OR=2.99，95%CI：1.721～15.193）和HLA-DQA1基因型（OR=10.412，95%CI：5.010～21.636）是婴儿发生CMPA的独立危险因素，纯母乳喂养时间≥4个月是儿童发生CMPA的保护因素（OR=0.405，95%CI：0.306～0.775）。 结论 HLA-DQ单核苷酸多态性与婴儿CMPA的发生有相关性，HLA-DQA1基因型可能是CMPA的易感基因型。

[关键词] HLA-DQ;单核苷酸多态性;牛奶蛋白过敏;相关性分析

[中图分类号] R512.6          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2022）08-0004-04

Correlation between HLA-DQ single nucleotide polymorphism and infant cow′s milk protein allergy

LI Caixue1  YU Chulie1  HE Jia2

1.Department of Pediatrics， Hangzhou Children′s Hospital， Hangzhou   310003，China;2.Department of Dermatology， Hangzhou Children′s Hospital， Hangzhou   310003，China

[Abstract] Objective To analyze the correlation between HLA-DQ single nucleotide polymorphism and infant cow′s milk protein allergy （CMPA）. Methods Eighty infants with CMPA （the CMPA group） and 80 healthy infants （the control group） who were diagnosed in Hangzhou Children′s Hospital from January to August 2020 were retrospectively collected as the research subjects， and the basic clinical information of the two groups was statistically analyzed. HLA-DQ single nucleotide polymorphism was analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR.The risk factors of CMPA were analyzed by multivariate logistic regression analysis. Results A total of 160 infants were included in this study. The duration of exclusive breastfeeding in the CMPA group was significantly shorter than that in the control group， and the family history of allergy and the frequency of HLA-DQA1 gene were significantly higher than those in the control group （P<0.05）. Multivariate logistic regression analysis showed that the family history of allergy（OR=2.99，95%CI： 1.721-15.193） and HLA-DQA1 genotype（OR=10.412，95%CI：5.010-21.636） were independent risk factors for CMPA in infants， and exclusive breastfeeding≥4 months was a protective factor for CMPA in children （OR=0.405，95%CI： 0.306-0.775）. Conclusion HLA-DQ single nucleotide polymorphism is associated with the occurrence of infant CMPA， and HLA-DQA1 genotype may be the susceptibility genotype of CMPA.

[Key words] HLA-DQ; Single nucleotide polymorphism （SNP）; Cow′s milk protein allergy （CMPA）; Correlation analysis

牛奶蛋白过敏（cow′s milk protein allergy，CMPA）是儿童常见的过敏性疾病之一，其主要引起患儿产生皮肤和消化系统等不良症状，且随着患儿年龄的增长可引起过敏性鼻炎和支气管哮喘[1-2]。引起儿童发生CMPA的因素有很多，其中遗传因素为主要因素之一[3]。人类白细胞抗原（HLA）基因是一组位于人类6号染色体上的基因复合体，是目前发现的人类最富多态性的基因群，其功能与人体免疫密切相关[4-5]。HLA-DQ是HLA基因的一个亚区，有研究显示，对哮喘患者的HLA-DQ进行检测，发现HLA-DQ基因在哮喘发病机制中有明确的显现，表明其与哮喘的发病存在一定的关联性[6]。目前关于HLA-DQ基因在牛奶蛋白过敏中的作用还未见报道，但是有研究显示，对3000多例日本小麦水解蛋白过敏患者进行HLA-DQ基因分析，发现HLA-DQA1与小麦水解蛋白过敏具有显著的相关性[7]。基于以上研究进展，笔者推测HLA-DQ可能与CMPA也存在一定的关联性，因此本研究选取HLA-DQA1和HLA-DQA2两个基因位点，以探讨HLA-DQ单核苷酸多态性与婴儿牛奶蛋白过敏的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取杭州市儿童医院儿内科2020年1～8月就诊的80名CMPA儿童作为病例组（CMPA组），另选80例既往无过敏史且身体健康体检的儿童作为对照组;本研究经医院医学伦理委员会批准，且已取得患儿家属知情同意。

1.2 CMPA诊断标准

本研究中对婴儿牛奶蛋白过敏的诊断标准采用2013版“中国婴幼儿牛奶蛋白过敏诊治循证建议”[8]，在婴儿接触牛奶过敏源后，突发荨麻疹、口腔过敏等症状或者迟发性胃肠道症状，可结合婴儿病史和家族史确诊为IgE介导的CMPA。采用免疫印迹法（Western blot）检测患儿特异性IgE抗体（CM-sIgE），当CM-sIgE≥0.35 IU/ml时，即为结果阳性。对所有疑似牛奶蛋白过敏的患儿进行干扰排除，具体方法为：①若婴儿为母乳喂养，则母亲禁止接触牛奶蛋白等相关产品;②若为非母乳喂养，则以深度水解蛋白奶粉或氨基酸奶粉代替;③若为母乳和奶粉混合喂养，则母亲禁止接触牛奶蛋白等相关产品的同时，婴儿采用深度水解蛋白奶粉或氨基酸奶粉喂養。若婴儿过敏症状无明显改善，则排除CMPA诊断。对诊断有所改善的婴儿采用口服牛奶激发试验，试验结果为阳性，则确诊为CMPA。牛奶激发试验：一滴牛奶滴在婴儿嘴唇，并逐渐增加牛奶用量，分别为1.0、3.0、10、30、50、100、200 ml。增量间隔时间20～30 min，并做好症状记录。若试验过程中婴儿出现之前过敏相同症状，则可确诊为CMPA，若未见明显症状，则继续观察72 h，避免漏诊[9]。

1.3 资料收集

通过本院儿内科和儿童保健科门诊问诊的方式，收集160例纳入样本的年龄、性别、是否早产儿、是否低出生体重儿、出生方式、纯母乳喂养时间和家族过敏史等信息。

1.4 DNA提取

采用EDTA抗凝管于清晨采集CMPA组和对照组空腹外周血2 ml，并使用南京建成生物有限公司生产的人血全基因组DNA提取试剂盒提取全基因组DNA，并于-20℃保存备用。

1.5 HLA-DQ基因分型

采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）对HLA-DQ基因分型分析，本研究选择两种最具代表性的两个基因型HLA-DQA1和HLA-DQA2，通过RT-PCR对两种基因型进行鉴定。实时定量反应体系为：模板DNA3.25 μl，SYBR Green qPCR SuperMix 16.25 μl，正向引物3.25 μl，反向引物3.25 μl，DEPC水6.5 μl，总共32.5 μl。反应条件为：95℃，10 min;95℃，10 s;60℃，30 s;72℃，20 s;共40个循环。PCR引物设计为：HLA-DQA1：正向引物5′-CATGCGTAGCAAGCT-CGCGACTG-3′，反向引物5′- CATGCGTAGCAAGCT-CGCGACTA -3′;HLA-DQA2：正向引物5′-CTTGGGATGCTACCAGCCGTCAG-3′，反向引物5′- CTTGGGATGCTACCAGCCGTCAA-3′。

1.6 统计学方法

采用SPSS 23.0统计学软件分析数据，计数资料以[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验，危险因素分析采用logistic回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床基本资料比较

2020年1～8月来杭州市儿童医院门诊就诊的儿童中，共有166例CMPA疑似病例，经过干扰排除和口服牛奶激发试验后，确诊CMPA患儿104例，经患儿家属知情同意，愿意抽血并纳入CMPA病例组的共80例，同时选取80名既往无过敏史且身体健康体检的儿童作为对照组。通过比较CMPA组和对照组儿童发现，两组儿童的性别、年龄、是否早产、是否低出生体重、出生方式比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;但两组儿童的纯母乳喂养时间和家族过敏史比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 CMPA组与对照组HLA-DQ基因分型比较

HLA-DQ是目前人类发现最富多态性的基因群，因此，本研究选择两种最具代表性的两个基因型HLA-DQA1和HLA-DQA2。通过比较CMPA组和对照组儿童发现，两组儿童基因型HLA-DQA2比较，差异均无统计学意义（P>0.05），但两组儿童在基因型HLA-DQA1比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 儿童发生CMPA影响因素的logistic回归分析

以是否发生CMPA为因变量，以单因素分析有意义的变量为自变量（否=0，是=1）进行logistic回归分析，结果显示纯母乳喂养时间≥4个月是儿童发生CMPA的保护因素，有家族过敏史和有HLA-DQA1基因型是儿童发生CMPA的危险因素。见表3。

3 讨论

食物过敏是一个日益严重的世界性健康问题，因为其发病率越来越高和潜在的生命威胁，且缺乏有效的预防治疗。婴儿和学龄前儿童食物过敏的患病率在日本为5%～10%，在英国为4.4%～5.3%，在美国为7.6%[10]。食物过敏对许多受试者来说是终生负担，目前尚无有效的治疗方法[11]。大多数食物过敏反应的过敏源包括相对食用较少的食物，如牛奶、鸡蛋、花生、坚果、海鲜、贝类、大豆和小麦等[12]。食物过敏被认为是由遗传和环境因素引起[13]。目前对食物过敏的基因研究主要都集中在花生过敏方向，据报道，HLA区域内的变异与花生过敏和自我报告的对虾和桃子的过敏反应有关[14]。牛奶是世界上消费最广泛的食品之一，牛奶中的牛奶蛋白被发现与各种疾病有关，如牛奶蛋白过敏等[15]。然而，目前的研究中很少进行牛奶过敏的遗传学研究，导致牛奶过敏性疾病的发病机制还不清楚，增加预防难度和临床治疗的风险。本研究将从基因多态性的角度，分析相关过敏基因与牛奶蛋白过敏发生的相关性，为牛奶蛋白过敏的防控提供参考。

多数过敏反应的发生是由于机体在接触过敏源后，体内过强的免疫应答反应造成的。辅助性T细胞1（Th1）与辅助性T细胞2（Th2）免疫功能的不平衡是导致发生CMPA的主要原因之一[16]。由于外在因素的影响，导致机体内Th2细胞数量大量增殖，从而导致具有免疫应答抑制作用的调节性T细胞（Treg）数量减少，同时功能受损[17]。Th2细胞因子大量分泌，使IgE抗体合成增加，因而加剧机体过敏炎症反应，最终引起多器官、多脏器的过敏反应[18]。本研究发现CMPA组儿童的家族过敏史比例显著高于对照组，这在一定程度上也可以反映CMPA的发病具有遗传特性，表明遗传因素可能会导致儿童发生CMPA的风险增加。本研究分析了两组儿童纯母乳喂养的时间，发现CMPA组纯母乳喂养时间小于4个月的比例显著高于对照组，表明母乳喂养在婴幼儿生长过程中的重要性，持续一定时间的母乳喂养，可有效减少儿童发生过敏的风险。

HLA基因位于人类染色体6P21上，其编码的蛋白多达132种，已被证实与多种疾病的发生密切相关，同时在参与机体的免疫调节机制中发挥重要的作用。HLA-DQ是HLA基因的一个基因区，由于其与过敏性疾病发生相关而受到廣泛的关注。国外有研究发现，HLA-DQ与机体免疫性疾病有显著的相关性，同时与机体因过强的免疫应答而产生的过敏反应关系密切[19]。HLA-DQA1和HLA-DQA2是HLA家族中明确确定的与机体免疫反应密切相关的基因，有研究发现，由于HLA-DQA1分子在免疫系统调节中的关键作用，导致其在感染性疾病当中HLA-DQA1频率更高，导致机体更加易感，使得感染更加常见[20]。本研究探讨HLA-DQA1和HLA-DQA2基因在CMPA和健康儿童中的分布情况，与对照组比较，CMPA组儿童HLA-DQA1基因频率更高，而两组HLA-DQA2基因频率无差异。在纳入单因素分析有意义的变量即纯母乳喂养、家族过敏史和HLA-DQA1基因频率后，进行logistic回归分析，发现家族过敏史和HLA-DQA1基因是CMPA发病的危险因素，说明HLA-DQA1基因可能是CMPA的易感基因。而HLA-DQA2基因频率在两组间无差异，表示HLA-DQA2基因可能不是CMPA的易感基因，但是后续还需要加大样本量来进行验证。当然，本研究也存在一定的局限性和不足，比如基因的作用通常是相互作用的，应了解HLA-DQ基因的相关作用机制及通路，进行系统性研究，以确保结果的准确性;同时应对儿童的生长环境进行分析，分析基因与环境的交互作用。因此在后续的进一步研究中，将综合考虑患儿的生活环境及体内相关免疫因子的表达水平，为牛奶蛋白过敏的防控提供更准确的建议。但本研究的结果对CMPA的遗传因素的分析具有一定的价值，同时有助于筛查CMPA高风险儿童。

综上所述，本研究发现HLA-DQ可能是CMPA的易感基因型，后续将扩大样本量，同时对现已诊断CMPA的患儿进行随访，以进一步确定HLA-DQ是否为CMPA的易感基因型。

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（收稿日期：2021-04-01）