血清胃泌素含量与胃癌患者病灶内上皮间质转化特征、JAK2/STAT3信号通路活化的相关性

陈明干，龚庆豪，戴刚，朱荣华，张捷

胃癌是我国常见的消化道恶性肿瘤，其具有浸润性生长的特征，向周围组织浸润的癌细胞也成为了胃癌根治术后肿瘤复发及转移的病理基础[1]。过度增强的上皮间质转化及过度激活的Janus相关激酶2(Janus associated kinase 2，JAK2)/信号传导与转录激活因子3(signal transduction and activators of transcription,STAT3)信号通路是与胃癌病灶浸润性生长直接相关的病理环节[2-3]，早期通过血清标志物的检测来评价病灶内的上皮间质转化及JAK2/STAT3信号通路激活程度，有助于及时判断胃癌恶性程度、探究胃癌发病分子机制。胃泌素是近年来新发现的胃癌标志物，胃癌患者血清胃泌素的分泌显著增多，但胃癌病理进程中受到胃泌素调控的生物学环节尚未明确。罗振国等[4]的细胞实验结果表明，胃泌素对胃癌细胞的上皮间质转化及JAK2/STAT3通路均具有活化作用。现分析血清胃泌素含量与胃癌患者病灶内上皮间质转化特征、JAK2/STAT3信号通路活化的相关性，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018年12月—2021年1月上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院普外科进行根治性切除手术的胃癌患者65例作为胃癌组，其中男37例，女28例，年龄41～65(59.93±11.32)岁；吸烟20例；合并高血压11例，糖尿病9例；均经术后病理学结果诊断为胃癌，临床资料完整且术前血清样本、术后病灶标本保留完整。选择同期在医院体检且排除消化道疾病病史的健康志愿者45例作为健康对照组，男26例，女19例，年龄38～58(58.48±9.29)岁；吸烟14例；合并高血压7例，糖尿病6例。2组性别、年龄、吸烟史及合并高血压、糖尿病情况比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准(2018120735)，受试者及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 观测指标与方法

1.2.1 血清胃泌素测定：胃癌组入组当天或次日、健康对照组体检当日收集受试者空腹肘静脉血3 ml，离心获取血清，采用时间分辨免疫荧光分析法(Thermo公司,SZ8382)测定胃泌素的含量。

1.2.2 病灶内基因表达测定：手术切除后取胃癌病灶及癌旁组织适量，采用北京康为世纪公司提供的试剂盒进行测定：首先通过Ultrapure RNA Kit试剂盒分离组织中的RNA，而后通过SuperRT One Step RT-PCR Kit试剂盒将RNA反转录合成cDNA；取cDNA 2 μl并与2×Taq Plus MasterMix试剂10 μl、引物混合液0.8 μl、去离子水7.2 μl混合，在PCR仪(ABI公司，7500型)上按照95℃ 20 s、特异性退火温度15 s、72℃ 20 s的反应程序重复40次，得到反应曲线并生成循环阈值(Ct)，代入公式2-ΔΔCt计算E-cadherin、Claudin4、N-cadherin、Vimentin、Snail、ZEB1、Slug、Twist、JAK2、STAT3、MMP9、CyclinD1的mRNA表达量。引物由上海生工公司设计及合成，引物序列及退火温度见表1。

表1 PCR反应所用引物序列及退火温度

2 结 果

2.1 2组血清胃泌素比较 胃癌组患者血清胃泌素含量为(19.31±2.24)pmol/L，显著高于健康对照组的(5.89±0.72)pmol/L(t=38.779，P<0.001)。

2.2 胃癌病灶与癌旁组织内上皮/间质转化标志基因表达量比较 胃癌病灶内E-cadherin、Claudin4的mRNA表达量明显低于癌旁组织，N-cadherin、Vimentin的mRNA表达量明显高于癌旁组织(P均<0.01)，见表2。

表2 胃癌病灶及癌旁组织内上皮/间质转化标志基因表达量比较

2.3 胃癌病灶与癌旁组织内上皮/间质转化转录因子表达量比较 胃癌病灶内Snail、ZEB1、Slug、Twist的mRNA表达量明显高于癌旁组织(P<0.01)，见表3。

表3 胃癌病灶及癌旁组织内上皮/间质转化转录因子表达量比较

2.4 胃癌病灶与癌旁组织内JAK2/STAT3信号分子表达量比较 胃癌病灶内JAK2、STAT3、MMP9、CyclinD1的mRNA表达量明显高于癌旁组织(P<0.01)，见表4。

表4 胃癌病灶及癌旁组织内JAK2/STAT3信号分子表达量比较

2.5 血清胃泌素与病灶内基因表达相关性 胃癌患者血清胃泌素含量与胃癌病灶内E-cadherin、Claudin4的mRNA表达量呈负相关，与胃癌病灶内N-cadherin、Vimentin、Snail、ZEB1、Slug、Twist、JAK2、STAT3、MMP9、CyclinD1的mRNA表达量呈正相关(P均<0.05)，见表5。

表5 血清胃泌素与病灶内基因表达相关性

3 讨 论

胃癌的早期诊断有赖于血清肿瘤标志物的测定及消化内镜下病灶的病理活检，胃泌素是近年来新发展起来的胃癌标志分子[5-6]。在生理条件下，胃泌素主要由胃窦G细胞分泌，十二指肠、空肠上段细胞也能分泌少量胃泌素；在胃黏膜上皮细胞发生恶变的过程中，胃泌素的分泌明显增多，进入血液循环能够成为肿瘤标志物，进入肿瘤病灶局部则能调控癌细胞的恶性生物学行为[7-8]。本研究对胃癌患者血清中胃泌素含量的分析与以往报道的结果一致，胃癌组患者血清中胃泌素含量高于健康对照组。在胃癌的病理进程中，癌细胞表现出极强的浸润性生长能力，胃泌素促进胃癌浸润性生长相关的基础研究表明，JAK2/STAT3通路的过度活化在胃泌素促进胃癌细胞上皮间质转化中发挥了重要作用[4]。基于此，本研究围绕胃泌素下游JAK2/STAT3通路及上皮间质转化分析胃癌患者血清中胃泌素变化的意义。

上皮间质转化是恶性肿瘤发病过程中重要的生物学特征，表现为极性强且不具迁移、运动能力的上皮特征细胞向无极性且运动能力极强的间质特征细胞分化。E-cadherin、Claudin4是上皮标志基因，能够维持细胞间的极性及紧密连接，进而使细胞锚定于局部组织、抑制细胞的迁移、运动[9-10]；N-cadherin、Vimentin是间质标志基因，能够增强细胞的迁移、运动能力[11-12]。在上皮间质转化过程中会出现E-cadherin、Claudin4表达下调，N-cadherin、Vimentin表达上调。本研究对胃癌病灶内相应基因表达的分析符合上皮间质转化的特征，即胃癌病灶内E-cadherin、Claudin4的表达量明显低于癌旁组织，N-cadherin、Vimentin的表达量明显高于癌旁组织；进一步通过相关性分析证实，胃癌患者的血清胃泌素含量与E-cadherin、Claudin4呈负相关，与N-cadherin、Vimentin呈正相关。这一结果提示，血清胃泌素含量的升高与胃癌病灶内上皮标志基因表达下调、间质基因表达上调有关，结合胃泌素的离体生物学活性可以进一步推测，胃癌患者体内大量分泌的胃泌素能够促进癌细胞的上皮间质转化。

上皮间质转化过程中标志基因表达的改变受到转录因子的调控，Snail、ZEB1、Slug、Twist是目前已知调控上皮间质转化作用最为明确的转录因子[13-15]，均能结合E-cadherin基因启动子区域的E-box序列，进而阻碍基因的表达。已有多项离体细胞实验研究证实，上述转录因子能够使多种癌细胞内的E-cadherin、Claudin4表达受到抑制，进而增强上皮间质转化过程[16-18]。在上述研究中对胃癌病灶内上皮间质转化转录因子的分析证实，胃癌病灶内Snail、ZEB1、Slug、Twist的表达量明显高于癌旁组织。这一结果表明，多种上皮间质转化转录因子在胃癌病灶内呈高表达的趋势，通过转录因子的改变能够使上皮间质转化过程得到增强并参与胃癌的病理进程[19-21]。在此基础上进一步分析胃癌患者体内胃泌素大量分泌与上皮间质转化转录因子高表达的相关性可知，胃癌患者血清中胃泌素的含量与胃癌病灶内Snail、ZEB1、Slug、Twist的表达量呈正相关。这一结果提示，胃癌患者体内大量分泌的胃泌素参与上皮间质转化的生物学作用可能与调节相应转录因子的表达有关。

JAK2/STAT3信号通路是与癌细胞恶性生物学特征密切相关的信号通路，JAK2能够介导生物学信号由细胞外向细胞内的转导，进而招募STAT3、使其发生活化并进入细胞核[22-23]；入核后的STAT3能够启动基因MMP9、CyclinD1的表达，前者介导细胞侵袭加剧，后者介导细胞周期加速[24-25]。已有离体细胞实验研究表明，JAK2/STAT3信号通路的过度激活与离体培养胃癌细胞增殖、侵袭能力的增强直接相关，当该信号通路发生激活时，细胞内MMP9、CyclinD1等下游基因的表达相应上调[26]。本研究发现，胃癌病灶内JAK2、STAT3、MMP9、CyclinD1的表达量明显高于癌旁组织，且与血清胃泌素含量呈正相关。这一结果提示血清胃泌素含量的升高与胃癌病灶内JAK2/STAT3通路的激活有关。

综上所述,胃癌患者血清胃泌素含量升高与上皮间质转化加剧及JAK2/STAT3信号通路过度激活有关，胃泌素能够参与胃癌细胞上皮间质转化及JAK2/STAT3信号通路激活的调控。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

陈明干：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；龚庆豪、戴刚：资料搜集整理;朱荣华：进行统计学分析;张捷：提出研究思路，分析试验数据，论文审核