病原宏基因组测序对肺部感染病原体检测价值以及影响因素分析

李江蕾，施 勇，任鸿芋，刘玲艳，樊亚雄

(楚雄州人民医院 呼吸与危重症医学科，云南 楚雄 675000)

肺部感染是常见的呼吸道感染性疾病，病原体多为细菌、病毒以及真菌。病原体的检测是针对性治疗的必要前提，但传统病原体培养法阳性率低，特别是在进行取样之前已经应用广谱抗生素进行治疗的患者。病原宏基因组测序(metagenornic next-generation sequencing，mNGS)，是通过对DNA/RNA的非靶向测序技术，可同时检测病毒、细菌、真菌以及寄生虫的序列，使病原体鉴定模式发生了革命性的变化，目前已在临床上开展应用[1]。最新临床研究显示，mNGS在肺部感染病原体检测中诊断准确性较高[2，3]。2020年病原学诊断专家共识中，肯定了mNGS在感染性疾病诊断领域中的优势[4]。本院自引进mNGS以后，已经完成对多名肺部感染患者病原体检测，本研究就mNGS的诊断效率以及影响因素做一分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2021年1月-2021年6月在本院住院并送检mNGS的肺部感染者 19 例，男14例，女5例，年龄56～72岁，平均年龄(65.82±8.77)岁。送检前化验结果为白细胞(12.10±6.26)×109/L；中性粒细胞(89.38±11.52)%；C反应蛋白(8.29±4.15)mg/L；降钙素原(2.26±1.88)ng/mL。

纳入标准：(1)根据患者临床表现、实验室检查、肺部影像学检查等诊断为肺部感染；(2)送检标本符合《肺部感染性疾病支气管肺泡灌洗病原体检测中国专家共识(2017)》的肺泡灌洗液标本[5]。(3)对肺泡灌洗和mNGS知情同意。

排除标准：(1)非感染性疾病；(2)无配对的传统培养；(3)因身体原因无法进行支气管镜检查以及肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)；(4)收集的样本未通过质量控制。

1.2 方法

1.2.1 样本收集

入组的患者入院后收集患者痰液5 mL，行肺泡灌洗后收集10 mL回收液体。通过血液途径检测的患者在入院后，抽取双侧静脉血共2份血液标本送检，高热的患者于热峰前30 min采集。同时将痰液、肺泡灌洗液、外周血用于mNGS检测以及院内病原学培养。

1.2.2 病原体培养与鉴定

按照《全国临床检验操作规程》(第 4 版)[6]相关流程操作，将样本分别接种于血琼脂平板、巧克力平板行细菌培养，接种于念珠菌显色平板、沙式葡萄糖琼脂培养基(Sabouraud Dextrose Agar，SDA)平板行真菌培养，分枝杆菌培养系统(MGIT960)进行分枝杆菌培养，对培养阳性的标本应用布鲁克质谱仪进行鉴定。

1.2.3 高通量测序

根据11ANaHlp Micr0 DNAKit[DP316，Tiagen]试剂盒步骤提取核酸。使用 Nextera XT DNA 样品制备试剂盒(MACHEREY-NAGEL)对 DNA 或 cDNA 制备文库。Agilent 2100(Agilent)质控，使用 Qubit dsDNA/RNA HS试剂盒定量文库浓度。Nextseq 550测序仪(Illumina)进行高通量测序。得出数据经FastQC 软件分析比对。

1.3 mNGS检测阳性标准[7]

在患者临床资料基础上，若符合以下任一条则认为阳性：(1)病毒RPM((Reads Per Million reads，每百万条序列比对到物种的序列数目)≥3，逆转录病毒RPM≥1000；(2)真菌RPM≥5；(3)胞内菌：如结核分枝杆菌RPM≥1。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 2种检测方法阳性、阴性检出结果对比

19例患者中，阳性标本14例，阳性率73.68%；培养阳性标本为9例，阳性率为47.37%。其中双阳性标本共9例(47.37%)，双阴性共5例(26.32%)。mNGS法检测出阳性率明显高于传统方法(P<0.05)，见表1。

2.2 2种检测手段检测出病原体情况

2.2.1 mNGS和传统检测方法检出病原体种类对比

mNGS方法检测出的病原体为2种混合感染的比例最高，占47.37%，而传统方法仅检测出一种病原体。2种及以上病原体检出率mNGS要明显高于传统方法(52.63% vs 0，P<0.05)，见表2。

表2 2种方法检测出病原体种类对比[n(%)]

2.2.2 mNGS和传统检测方法分离出的病原体

铜绿假单胞菌和流感嗜血杆菌最为常见(3/25)，其次为人类疱疹病毒4型和7型、细环病毒、星座链球菌、肺炎链球菌、白色念珠菌(均为2/25)，见表3。

表3 2种检测手段检测出病原体株数(株)

2.3 mNGS检测阳性影响因素单因素分析

mNGS阳性患者在检测前使用过抗生素、白细胞数量、CRP水平等差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

图1 mNGS与传统培养检测的病原体分布

表4 mNGS检测阳性影响因素单因素分析

2.4 mNGS检测阳性影响因素多因素分析

以检测前使用过抗生素、白细胞数量、CRP水平纳入统计，经Logistic多因素回归分析得出，3者均非mNGS检测阳性的影响因素(P>0.05)，见表5。

表5 mNGS检测阳性影响因素多因素分析

3 讨论

传统病原体培养检测方法受到标本污染、抗生素使用等因素影响，阳性率低、灵敏度特异度不高、时效性不佳。mNGS作为新一代技术，具有高通量和快速检测等特点。目前报道mNGS临床临床符合率在65%～100%不等[8～10]。本试验搜集了本院近半年应用mNGS进行病原体检测的肺部感染的患者19例，其中[1]14例检测出病原体，阳性检出率为73.68%，远高于传统方法。本mNGS结果还显示，52.63%的感染为混合感染，而传统方法仅能检测出单一病原体。

Li等[11]应用mNGS对肺炎患者致病菌分析显示，最常见的为不动杆菌属，韦荣氏菌属，假单胞菌属和罗氏菌属以及耶氏肺孢子菌。Xie 等[12]的研究则发现肺部灌洗液mNGS检测下最常见的为鲍曼不动杆菌，其次为铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球。本研究对入选的19例患者mNGS检测结果显示致病菌为铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、人类疱疹病毒4型、人类疱疹病毒7型、细环病毒、星座链球菌、肺炎链球菌和白色念球菌。不同研究的病原谱差异主要是因为：(1)收集的患者所处的环境不一样；(2)入选患者感染程度不一样，本研究入选的患者多为轻症为主，而上述研究的患者多为重症肺炎。

早期广谱抗生素或预防性抗菌药物的使用会阻碍传统病原体的培养。Miao Q等[13]将感染患者分为已用抗生素组和未用抗生素组，并对比2组应用mNGS和传统方法的检出率，结果显示应用mNGS法差异不显著，而传统方法2组差异较大，提示抗生素对mNGS影响较小。本研究通过单因素以及多因素分析显示，早期应用抗生素并不是影响mNGS病原体检出率的因素，与上述研究结论一致。

综上可见，mNGS对肺部感染病原体检出率高，且受抗生素的影响相对培养法较小，有助于临床上对病因不明、抗生素暴露、免疫缺陷等患者的病原学诊断，为精准治疗带来希望。但mNGS是否可以替代传统检测方法，目前仍缺乏更多真实世界的研究。本研究不足之处在于样本量过少，期望临床能进一步扩大样本量统计分析，增加结论的可靠性。