葡聚糖硫酸钠诱导不同性别溃疡性结肠炎小鼠模型的比较

张琳珮，陆洪艳，史雯雪，蒋霞

广西医科大学第一附属医院，广西 南宁 530021

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）属于炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的一种，是一种非特异性肠道炎症性疾病，其病程长，病情轻重不等，是近年来发病率逐渐升高且难以治愈的疾病之一［1］。基础研究中建立符合疾病发展特点的动物模型至关重要，在现有的复制UC 动物模型的基础研究中，探讨较多的是实验动物的种属、周龄、模型制作方法等［2-5］，但尚未见有讨论3%葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）溶液诱导UC动物模型性别差异的研究。本实验通过给雌性、雄性C57BL/6J 小鼠自由饮用3% DSS 溶液复制UC 动物模型，分析不同性别小鼠UC 模型的疾病活动指数（disease activity index，DAI），病死率，成模率，结肠长度，脾脏系数，结肠病理变化，来探讨性别差异对UC 模型的影响。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

葡聚糖硫酸钠（相对分子质量为35 000～50 000，美国MP），批号：S4140；粪便隐血定性检测试剂盒（邻联甲苯胺法，北京雷根），批号：TC0511；HE 染液套装（武汉赛维尔），货号：G1003。

1.2 仪器

L204 电子天平（上海梅特勒托利多）；Milli-Q A10 超纯水系统（美国Millipore）；VORTEX GENIUS 3型涡旋振荡仪（德 国IKA）；Thermo Scientific SL 8R 型高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher）；生物倒置相差显微镜（日本奥林巴斯）；脱水机（DIAPATH）；包埋机（武汉俊杰）；病理切片机（上海徕卡）。

1.3 动物

雌性、雄性C57BL/6J 小鼠，SPF 级，6-8 周龄，体质量18～22 g，SPF 级，由广西医科大学动物实验中心提供［实验室许可证号：SYXK（桂）2020-0004］。

1.4 方法

1.4.1 使用3% DSS 溶液诱导UC 动物模型 健康雌性、雄性C57BL/6J 小鼠24 只，随机分为雌性对照组、雄性对照组、雌性DSS 组和雄性DSS 组，每组6 只。适应性喂养1 周后，雌性、雄性对照组正常供给饲料、饮水，雌性、雄性DSS 组给予正常饮食+3% DSS 溶液造模自由饮用7 d 进行造模［6］。

1.4.2 检测指标及方法（1）一般情况及结肠长度测量：每日观察并记录小鼠的一般情况：精神状态、体质量、进食量、毛色光泽、粪便性状及隐血等。在第8 天用10%水合氯醛腹腔注射麻醉处死小鼠后，解剖小鼠，测量结肠总长度。（2）疾病活动指数（DAI）：自试验d0 开始，每日固定时间称量各组小鼠体质量，记录每只小鼠的粪便性状，运用粪便隐血定性检测试剂盒（邻联甲苯胺法）检测粪便隐血情况。体质量的变化以基线体质量下降的百分比表示：体质量变化(%)=［1+(造模后体质量-造模前体质量)/造模前体质量］×100%。按表1 计算DAI 指数评分，DAI=(体质量下降分数+粪便性状分数+血便分数)/3［7］。（3）脾脏系数：摘取小鼠脾脏，量取脾脏质量，计算脾脏系数。脾脏系数（%）=［脾脏质量（mg）/处死前小鼠体质量（g）］×100%。（4）结肠病理切片观察—苏木精-伊红（HE）染色检测：剖腹后，剪取距肛门以上2 cm 结肠，剔除肠系膜，取病变最明显处结肠组织2～3 cm，沿纵轴剪开，用生理盐水清理肠内容物，放置于4%多聚甲醛中固定，按常规包埋、切片，HE 染色后，在光学显微镜下观察结肠组织病理变化。

表1 DAI评分标准

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠一般状况及体质量变化

实验期间，两对照组小鼠精神状态良好、反应灵敏、皮毛光亮，体质量缓慢增长，大便正常。DSS 组小鼠饮用3% DSS 溶液后，两组小鼠体质量均不同程度下降，蜷缩聚堆，精神萎靡，饮食量减少，拱背，皮毛枯槁无光泽，伴有黏液稀便、肉眼血便等症状。小鼠在活动性结肠炎期间通常体重减重10%～20%，根据伦理规则，体质量减轻20%～25%或更多被认为是终止实验的标准［2］。与雌性对照组比较，雌性DSS 组体质量明显减少（P＜0.01）；与雄性对照组比较，雄性DSS 组体质量明显减少（P＜0.01）。与雄性DSS 组比较，雌性DSS 组体质量减少幅度更小（P＜0.01）。见图1、表2。

图1 各组小鼠体质量变化

表2 各组小鼠体质量及变化（）

表2 各组小鼠体质量及变化（）

注：与同性别对照组比较，aP＜0.01，不同性别DSS组比较，bP＜0.01。

2.2 小鼠DAI 指数、病死率、成模率结果分析

自由饮用3% DSS 溶液诱导的UC 小鼠模型评价标准之一：造模后小鼠出现精神倦怠、饮食量下降、体质量减少并伴有黏液稀便、血便等症状。实验期间，雌性和雄性DSS 组均出现不同程度的上述症状，表明造模成功。雄性DSS 组小鼠d2 开始出现黏液便及松散粪便，d3 开始出现粪便隐血阳性，d4 大部分小鼠出现肉眼血便，DAI 指数显著升高，在d4、d5 各有1 只死亡，d7 整组小鼠体质量均减少＞25%（体质量减少＞25%应终止实验）；雌性DSS 组小鼠d4 开始出现黏液便及粪便隐血阳性，d5 有1 只小鼠死亡，部分小鼠出现肉眼血便，DAI指数逐渐升高，症状出现时间及程度均明显比雄性DSS 组轻。雌性和雄性DSS 小鼠DAI 指数均分别显著高于同性别对照组小鼠（P＜0.05），其中雌性DSS 组DAI 指数较雄性DSS 组低（P＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠的DAI 指数、病死率、成模率分析

2.3 小鼠结肠长度、脾脏系数

在UC 模型实验中，随着炎症的加重，结肠出现缩短的情况［8］。两对照组小鼠结肠组织均匀光滑，无水肿充血情况，粪便成型，而雌性和雄性DSS组小鼠结肠均出现明显缩短的情况，结肠充血、肿胀，没有成型粪便，结肠内可见血色粪便，如图2示。雌性DSS 组中小鼠的结肠长度与对照组相比，结肠长度减少了23.6%，而雄性DSS 组中小鼠的平均结肠长度与对照组相比减少了31.6%，均差异有统计学意义（P＜0.01）。雌性DSS 组结肠缩短长度明显低于雄性DSS 组（P＜0.05）。

图2 各组小鼠结肠组织图

与对照组比较，雌性和雄性DSS 组脾脏器系数均显著提高，差异有统计学意义（P＜0.01）；在同性别DSS 组中与雄性对照组比较，雌性DSS 组脾脏器系数增长较少（P＜0.01）。见表4。

表4 3% DSS对小鼠的结肠长度、脾脏器系数的影响（）

表4 3% DSS对小鼠的结肠长度、脾脏器系数的影响（）

注：与同性别对照组比较，aP＜0.01；不同性别DSS组比较，bP＜0.05，cP＜0.01。

2.4 小鼠结肠组织病理学变化

雌性、雄性对照组小鼠结肠黏膜结构完整光滑，未见炎性、坏死的细胞、糜烂及溃疡等。雌性、雄性DSS 组通过3% DSS 溶液诱导后出现了典型的UC 的病理变化：均可见结肠黏膜上皮细胞大量脱落形成溃疡，伴大量炎性细胞浸润，排列紊乱，侵入黏膜下层及肌层，但雌性DSS 组较雄性DSS 组黏膜充血水肿轻，黏膜下层及肌层炎症细胞浸润较雄性DSS 组少，可见少量完整杯状细胞。见图3。

图3 3% DSS溶液对UC小鼠结肠组织病理变化的影响（HE，×200）

3 讨论

UC 是目前最常见的炎性肠道性疾病，其发病机制、病因尚未完全明确，目前多认为其发病可能由环境、感染、遗传和免疫等多重因素相互影响［9-10］。UC 模型的建立是基础研究工作的第一步，建立与人类UC 相似的动物模型有助于开展UC 的机制及治疗研究。DSS 是一种带负电荷的葡萄糖聚合物，对结肠黏膜具有破坏性，可使肠黏膜通透性增加，引发炎症反应［11］。研究发现由一定浓度的DSS 溶液诱导的UC 动物模型是目前研究UC发病机制及评估某些药物治疗疗效应用最广泛的模型之一，其诱导的结肠炎动物模型病理表现、临床症状与人类UC 相似［12-13］。

目前小鼠UC 模型的建立方法有多种，但少有对性别差异与动物模型影响因素的相关研究。本实验通过最常用的3%DSS 溶液诱导UC 小鼠动物模型进行了关于动物性别差异的研究，并成功诱导出了UC 的疾病模型，首次证实了3% DSS 溶液诱导下性别差异与UC 小鼠模型病理程度密切相关，甚至可能影响UC 模型的成模率。本实验发现雄性小鼠的DAI 指数水平显著高于雌性小鼠，但雌性小鼠病死率低于雄性小鼠。由此可见，雌性小鼠可能更易于模型的诱导，且该方法容易复制，成模率高，病死率低。

建立符合人类UC 疾病特点的实验动物模型是基础研究的重点，但UC 实验动物模型的建立方法仍缺少一个统一的评判标准，且影响因素较多，如动物的种属选择与周龄大小、模型诱导方法（包括诱导试剂的浓度、诱导周期等）、实验室检测指标等等，本实验对常用的化学法诱导的UC 动物模型的性别因素进行了研究，为后期实验人员建立UC动物模型对动物性别的选择提供参考依据，但寻找一种UC 临床相似度高的实验动物模型尚需进一步探索。