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葡聚糖硫酸钠诱导不同性别溃疡性结肠炎小鼠模型的比较

2022-04-27张琳珮陆洪艳史雯雪蒋霞

药品评价 2022年3期
关键词:动物模型脾脏雌性

张琳珮,陆洪艳,史雯雪,蒋霞

广西医科大学第一附属医院,广西 南宁 530021

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)属于炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)的一种,是一种非特异性肠道炎症性疾病,其病程长,病情轻重不等,是近年来发病率逐渐升高且难以治愈的疾病之一[1]。基础研究中建立符合疾病发展特点的动物模型至关重要,在现有的复制UC 动物模型的基础研究中,探讨较多的是实验动物的种属、周龄、模型制作方法等[2-5],但尚未见有讨论3%葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)溶液诱导UC动物模型性别差异的研究。本实验通过给雌性、雄性C57BL/6J 小鼠自由饮用3% DSS 溶液复制UC 动物模型,分析不同性别小鼠UC 模型的疾病活动指数(disease activity index,DAI),病死率,成模率,结肠长度,脾脏系数,结肠病理变化,来探讨性别差异对UC 模型的影响。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

葡聚糖硫酸钠(相对分子质量为35 000~50 000,美国MP),批号:S4140;粪便隐血定性检测试剂盒(邻联甲苯胺法,北京雷根),批号:TC0511;HE 染液套装(武汉赛维尔),货号:G1003。

1.2 仪器

L204 电子天平(上海梅特勒托利多);Milli-Q A10 超纯水系统(美国Millipore);VORTEX GENIUS 3型涡旋振荡仪(德 国IKA);Thermo Scientific SL 8R 型高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher);生物倒置相差显微镜(日本奥林巴斯);脱水机(DIAPATH);包埋机(武汉俊杰);病理切片机(上海徕卡)。

1.3 动物

雌性、雄性C57BL/6J 小鼠,SPF 级,6-8 周龄,体质量18~22 g,SPF 级,由广西医科大学动物实验中心提供[实验室许可证号:SYXK(桂)2020-0004]。

1.4 方法

1.4.1 使用3% DSS 溶液诱导UC 动物模型 健康雌性、雄性C57BL/6J 小鼠24 只,随机分为雌性对照组、雄性对照组、雌性DSS 组和雄性DSS 组,每组6 只。适应性喂养1 周后,雌性、雄性对照组正常供给饲料、饮水,雌性、雄性DSS 组给予正常饮食+3% DSS 溶液造模自由饮用7 d 进行造模[6]。

1.4.2 检测指标及方法(1)一般情况及结肠长度测量:每日观察并记录小鼠的一般情况:精神状态、体质量、进食量、毛色光泽、粪便性状及隐血等。在第8 天用10%水合氯醛腹腔注射麻醉处死小鼠后,解剖小鼠,测量结肠总长度。(2)疾病活动指数(DAI):自试验d0 开始,每日固定时间称量各组小鼠体质量,记录每只小鼠的粪便性状,运用粪便隐血定性检测试剂盒(邻联甲苯胺法)检测粪便隐血情况。体质量的变化以基线体质量下降的百分比表示:体质量变化(%)=[1+(造模后体质量-造模前体质量)/造模前体质量]×100%。按表1 计算DAI 指数评分,DAI=(体质量下降分数+粪便性状分数+血便分数)/3[7]。(3)脾脏系数:摘取小鼠脾脏,量取脾脏质量,计算脾脏系数。脾脏系数(%)=[脾脏质量(mg)/处死前小鼠体质量(g)]×100%。(4)结肠病理切片观察—苏木精-伊红(HE)染色检测:剖腹后,剪取距肛门以上2 cm 结肠,剔除肠系膜,取病变最明显处结肠组织2~3 cm,沿纵轴剪开,用生理盐水清理肠内容物,放置于4%多聚甲醛中固定,按常规包埋、切片,HE 染色后,在光学显微镜下观察结肠组织病理变化。

表1 DAI评分标准

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠一般状况及体质量变化

实验期间,两对照组小鼠精神状态良好、反应灵敏、皮毛光亮,体质量缓慢增长,大便正常。DSS 组小鼠饮用3% DSS 溶液后,两组小鼠体质量均不同程度下降,蜷缩聚堆,精神萎靡,饮食量减少,拱背,皮毛枯槁无光泽,伴有黏液稀便、肉眼血便等症状。小鼠在活动性结肠炎期间通常体重减重10%~20%,根据伦理规则,体质量减轻20%~25%或更多被认为是终止实验的标准[2]。与雌性对照组比较,雌性DSS 组体质量明显减少(P<0.01);与雄性对照组比较,雄性DSS 组体质量明显减少(P<0.01)。与雄性DSS 组比较,雌性DSS 组体质量减少幅度更小(P<0.01)。见图1、表2。

图1 各组小鼠体质量变化

表2 各组小鼠体质量及变化()

表2 各组小鼠体质量及变化()

注:与同性别对照组比较,aP<0.01,不同性别DSS组比较,bP<0.01。

2.2 小鼠DAI 指数、病死率、成模率结果分析

自由饮用3% DSS 溶液诱导的UC 小鼠模型评价标准之一:造模后小鼠出现精神倦怠、饮食量下降、体质量减少并伴有黏液稀便、血便等症状。实验期间,雌性和雄性DSS 组均出现不同程度的上述症状,表明造模成功。雄性DSS 组小鼠d2 开始出现黏液便及松散粪便,d3 开始出现粪便隐血阳性,d4 大部分小鼠出现肉眼血便,DAI 指数显著升高,在d4、d5 各有1 只死亡,d7 整组小鼠体质量均减少>25%(体质量减少>25%应终止实验);雌性DSS 组小鼠d4 开始出现黏液便及粪便隐血阳性,d5 有1 只小鼠死亡,部分小鼠出现肉眼血便,DAI指数逐渐升高,症状出现时间及程度均明显比雄性DSS 组轻。雌性和雄性DSS 小鼠DAI 指数均分别显著高于同性别对照组小鼠(P<0.05),其中雌性DSS 组DAI 指数较雄性DSS 组低(P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠的DAI 指数、病死率、成模率分析

2.3 小鼠结肠长度、脾脏系数

在UC 模型实验中,随着炎症的加重,结肠出现缩短的情况[8]。两对照组小鼠结肠组织均匀光滑,无水肿充血情况,粪便成型,而雌性和雄性DSS组小鼠结肠均出现明显缩短的情况,结肠充血、肿胀,没有成型粪便,结肠内可见血色粪便,如图2示。雌性DSS 组中小鼠的结肠长度与对照组相比,结肠长度减少了23.6%,而雄性DSS 组中小鼠的平均结肠长度与对照组相比减少了31.6%,均差异有统计学意义(P<0.01)。雌性DSS 组结肠缩短长度明显低于雄性DSS 组(P<0.05)。

图2 各组小鼠结肠组织图

与对照组比较,雌性和雄性DSS 组脾脏器系数均显著提高,差异有统计学意义(P<0.01);在同性别DSS 组中与雄性对照组比较,雌性DSS 组脾脏器系数增长较少(P<0.01)。见表4。

表4 3% DSS对小鼠的结肠长度、脾脏器系数的影响()

表4 3% DSS对小鼠的结肠长度、脾脏器系数的影响()

注:与同性别对照组比较,aP<0.01;不同性别DSS组比较,bP<0.05,cP<0.01。

2.4 小鼠结肠组织病理学变化

雌性、雄性对照组小鼠结肠黏膜结构完整光滑,未见炎性、坏死的细胞、糜烂及溃疡等。雌性、雄性DSS 组通过3% DSS 溶液诱导后出现了典型的UC 的病理变化:均可见结肠黏膜上皮细胞大量脱落形成溃疡,伴大量炎性细胞浸润,排列紊乱,侵入黏膜下层及肌层,但雌性DSS 组较雄性DSS 组黏膜充血水肿轻,黏膜下层及肌层炎症细胞浸润较雄性DSS 组少,可见少量完整杯状细胞。见图3。

图3 3% DSS溶液对UC小鼠结肠组织病理变化的影响(HE,×200)

3 讨论

UC 是目前最常见的炎性肠道性疾病,其发病机制、病因尚未完全明确,目前多认为其发病可能由环境、感染、遗传和免疫等多重因素相互影响[9-10]。UC 模型的建立是基础研究工作的第一步,建立与人类UC 相似的动物模型有助于开展UC 的机制及治疗研究。DSS 是一种带负电荷的葡萄糖聚合物,对结肠黏膜具有破坏性,可使肠黏膜通透性增加,引发炎症反应[11]。研究发现由一定浓度的DSS 溶液诱导的UC 动物模型是目前研究UC发病机制及评估某些药物治疗疗效应用最广泛的模型之一,其诱导的结肠炎动物模型病理表现、临床症状与人类UC 相似[12-13]。

目前小鼠UC 模型的建立方法有多种,但少有对性别差异与动物模型影响因素的相关研究。本实验通过最常用的3%DSS 溶液诱导UC 小鼠动物模型进行了关于动物性别差异的研究,并成功诱导出了UC 的疾病模型,首次证实了3% DSS 溶液诱导下性别差异与UC 小鼠模型病理程度密切相关,甚至可能影响UC 模型的成模率。本实验发现雄性小鼠的DAI 指数水平显著高于雌性小鼠,但雌性小鼠病死率低于雄性小鼠。由此可见,雌性小鼠可能更易于模型的诱导,且该方法容易复制,成模率高,病死率低。

建立符合人类UC 疾病特点的实验动物模型是基础研究的重点,但UC 实验动物模型的建立方法仍缺少一个统一的评判标准,且影响因素较多,如动物的种属选择与周龄大小、模型诱导方法(包括诱导试剂的浓度、诱导周期等)、实验室检测指标等等,本实验对常用的化学法诱导的UC 动物模型的性别因素进行了研究,为后期实验人员建立UC动物模型对动物性别的选择提供参考依据,但寻找一种UC 临床相似度高的实验动物模型尚需进一步探索。

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