基于HPLC 法测定王不留行不同炮制品中主成分含量

黄检平，周鸣，陈秀娟，李晶，高慧，叶喜德

1.上高县中医院，江西 上高 336400；2.江西中医药大学，江西 南昌 330004；3.福州市长乐区妇幼保健院，福建 福州 350200

王不留行为石竹科植物麦蓝菜［Vaccaria segetalis（Neck.）Garcke］的干燥成熟种子，在夏季果实成熟、果皮尚未开裂时采收［1］。其味苦性平，主入肝胃经，具活血通络、下乳消肿、利尿祛湿之功［2］。临床常以复方入药以治疗女性闭经、痛经、母乳不降、乳房脓肿肿痛、淋证涩痛等证［3-5］。主含黄酮类、生物碱、三萜皂苷、环肽、多糖和挥发油等成分，其中王不留行黄酮苷（vaccarin）和刺桐碱（hypaphorine）是其主要有效成分。前者具有促进乳汁分泌、血管新生、内皮细胞增殖，改善内皮损伤、肝脏糖脂代谢紊乱，抑制高血糖、高血压、高血脂等药理作用［6］。而刺桐碱具抗炎、增强免疫和抗肝损伤等作用［7］。历代医学典籍记载，王不留行炮制方法较多，如制炭、清蒸、酒蒸和清炒等［8］。目前《中国药典》2020 版只保留了生品和清炒品两种规格，而其他古法炮制多已不用且研究较少。在炒制法中，王不留行除清炒外，现衍化出其他许多不同炮制方法，如润炒法、酒炒法、油砂炒法等［9］。在对其炮制工艺研究时，王不留行中的刺桐碱和王不留行黄酮苷常作为其重要的质量评价指标［10］。由于中药在临床应用前必须进行炮制，而不同炮制方法涉及的因素各异，从而对药材化学成分产生不同的影响，进而影响药效。基于此，本研究基于HPLC法测定王不留行不同炮制品中刺桐碱和王不留行黄酮苷的含量，以比较不同炮制方法对王不留行主要有效成分含量变化的影响，为深入研究提供参考。

1 试验材料

1.1 仪器设备

Agilent 1100 高效液相色谱仪（安捷伦仪器有限公司）；FA1004N 万分之一电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；YF-111B 高速中药粉碎机（瑞安市永历制药机械有限公司）；十万分之一分析天平ESJ180-4，沈阳龙腾电子有限公司；KQ-500E 超声波清洗器（120 W，40 kHz，昆山市超声仪器有限公司）；TDL-80-2C 低速离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 药材

王不留行药材购自安徽汇仁堂中药饮片有限公司，经江西中医药大学龚千峰教授鉴定为石竹科植物麦蓝菜的干燥成熟种子。

1.3 试剂

王不留行黄酮苷对照品（四川省维克奇生物有限公司，批号：wkq20060206，质量分数≥98%）；刺桐碱对照品（四川省维克奇生物有限公司，批号：wkq20070902，质量分数≥98%）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为双蒸水，江西中医药大学大型精密仪器共享服务中心（简称大仪中心）制备。

2 方法与结果

2.1 王不留行炮制品的制备

2.1.1 生品 取100 g 王不留行药材，筛去杂质后洗净晒干。用塑料封口袋密封保存，做好标签，备用。

2.1.2 清炒品 取王不留行药材100 g，筛去杂质后洗净晒干，确保其充分干燥。用中火把锅预热，投入少许王不留行，王不留行入锅即爆花后，投入剩余药材，用小竹帚同方向连续炒制大部分爆白花，出锅，放凉。用塑料封口袋密封保存，做好标签，备用。

2.1.3 润炒品［11］取王不留行药材100 g，筛去杂质后洗净晒干，使其充分干燥。干燥后用10 g 左右的水浸润，浸润15 min 左右。用中火把锅预热后，投入少许王不留行试药，待王不留行一入锅就爆花后，倒入剩余王不留行，用小竹帚同方向连续炒制大部分爆白花，取出晾凉，用塑料封口袋密封保存，做好标签，备用。

2.1.4 酒炒品 取王不留行药材100 g，筛去杂质，洗净晒干，确保其充分干燥。充分干燥后加入10 g左右的黄酒拌匀，浸润15 min 左右，同上用中火预热锅和试药后，倒入王不留行，用小竹帚同方向连续炒制大部分爆白花，出锅，放凉，用塑料封口袋密封保存，做好标签，备用。

2.1.5 油制品［12］取2 号筛至3 号筛之间的中粗砂，筛去石子，洗净，晾干，放入锅中加热，加入食用油约10 g，用武火翻炒至油完全散开，待砂色均匀、深沉后取出，冷却备用。将筛去杂质并洗净的王不留行充分干燥，用中武火把锅预热，把200 g 左右的砂子投入锅内翻炒至砂子处于滑利状态。投入少许王不留行试药，王不留行入锅即爆花后，投入100 g 药材，用小竹帚同方向连续炒制大多数爆成白花时，出锅，放凉，筛砂。用塑料封口袋密封保存，做好标签，备用。

将制备好的5 种王不留行炮制品粉碎成粉末，通过3 号筛，装袋并做标记。各炮制品中辅料和药物的比例见表1。

表1 不同炮制方法参数（g/100g）

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件色谱柱 Tnature C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1% 甲酸水（B），梯度洗脱（0～10 min，13% A；10～20 min，13%→20% A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；进样量:5 μL。各溶液色谱图见图1。

图1 各待测液HPLC色谱图：A.刺桐碱、王不留行黄酮苷混合对照品；B.生品；C.清炒品；D.润炒品；E.酒炒品；F.油制品

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取刺桐碱对照品、王不留行黄酮苷对照品，分别加色谱级甲醇制成浓度为1.13 mg/mL、1.02 mg/mL 的对照品溶液的刺桐碱和王不留行黄酮苷母液。从母液中吸取刺桐碱50 μL、王不留行黄酮苷225 μL 至同一样品瓶中，再吸取725 μL 色谱级甲醇至样品瓶中，混合均匀，配成每1 mL 含刺桐碱56.5 μg、王不留行黄酮苷229.5 μg的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密称取王不留行不同炮制品粉末1.0 g，精密称定，装入15 mL 的EP 管中，首次提取加入5.5 mL 50%甲醇水溶液，Vortexfor 混旋至粉末完全溶于甲醇水溶液中且混合均匀（即EP 管底部不残留粉末）。然后在常温下超声提取30 min，取出放至温室，3 000 rpm 离心10 min，倾取上清液，放入10 mL 容量瓶中。重复以上步骤，连续反复提取3 次（第2、3 次添加溶剂量约3.5 mL），合并3 次提取液，定容至10 mL。提取液先经0.45 µL 的微孔滤膜过滤，去除1 mL 后，用5 mL 的一次性注射器注入到10 mL 样品瓶中，留样备用。再从该样品瓶中用1 mL 的一次性注射器吸取1 mL 的提取液，经0.22 µL 微孔滤膜过滤，去除前面2 滴后，注入到样品瓶，即为供试品。将已经制备好的样品冷藏保存。

2.2.4 标准曲线制备 精密吸取混合对照品溶液2、4、6、8、10、12、14 μL，按“2.2.1”项下色谱条件测定，以峰面积为纵坐标（Y），对照品进样量为横坐标（X），绘制标准曲线，结果见表2。

表2 刺桐碱、王不留行黄酮苷标准曲线

2.2.5 精密度试验 吸取“2.2.2”项下刺桐碱、王不留行黄酮苷对照品母液各100 μL 至样品瓶（内置内插管），充分混匀，制成混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，进样量5 μL，连续进样6 次，记录各成分峰面积，计算得到刺桐碱、王不留行黄酮苷峰面积的RSD 分别为1.18%，1.25%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于配制后0、3、6、9、12、24 h，按“2.2.1”项下色谱条件进样5 μL，计算得到刺桐碱、王不留行黄酮苷峰面积的RSD 分别为2.04%，1.43%，表明供试品在24 h 内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 按“2.2.3”项方法平行制备王不留行供试品溶液6 份。按“2.2.1”项下色谱条件进样5 μL，计算得到刺桐碱、王不留行黄酮苷峰面积的RSD 分别为1.72%，1.60%，表明方法重复性良好。

2.2.8 样品含量测定 分别称取1.0 g 王不留行5 种炮制品粉末，按“2.2.3”的方法配制供试品溶液，按“2.2.1”的色谱条件测定其中刺桐碱和王不留行黄酮苷的含量。结果见表3。

表3 不同炮制品中刺桐碱、王不留行黄酮苷的含量（n=3，mg/g）

3 讨论与小结

王不留行主要成份王不留行黄酮苷，含量易受外界环境因素的影响而发生变化，从而影响药材的质量。该药材虽有许多不同炮制品，但《中国药典》主要以清炒品为主。由于清炒法涉及加热温度、时间等环节，这些因素势必会影响王不留行中化学成分含量，进而影响饮片质量。

目前对王不留行的研究，主要集中在对临床应用和化学成分的研究，而临床使用的王不留行多以清炒法为主，而砂炒法也逐渐在企业中应用，被认为是王不留行最佳炮制方法［13］。在炮制方面，主要是比较王不留行炮制前后药效差异，但并未开展其炮制机制研究。因此，课题组选择不同炮制方法对刺桐碱和王不留行黄酮苷等含量的影响，目的是探讨不同炮制方法对王不留行主要有效成分的影响，以确立发生炮制变化的生物标志物。因此，基于HPLC 法测定王不留行不同炮制品中刺桐碱和王不留行黄酮苷的含量差异，为优选王不留行优质饮片提供科学依据。本研究结果表明，刺桐碱和王不留行黄酮苷含量以生品最高，不同炮制品的刺桐碱和王不留行黄酮苷含量存在差异。如表3 所示，炮制对王不留行中刺桐碱的含量影响不大，而对王不留行黄酮苷的影响显著。相比生品，油制品中王不留行黄酮苷含量显著下降，刺桐碱的含量亦是下降最多；其他炮制方法比生品也相应降低，其中清炒法下降最少。实验结果说明，不同炮制方法对王不留行中刺桐碱和王不留行黄酮苷的含量产生影响，这种变化与加热时间、温度等方面存在关联，从而导致生物碱类和黄酮类成分破坏流失［14］。

本试验比较了不同炮制方法王不留行中刺桐碱、王不留行黄酮苷的含量变化，测定方法稳定，实验数据可靠，可为其炮制工艺的改进和新工艺的建立提供数据支撑。试验所用的HPLC 测定中药含量的方法，重复性高，简单易行。但纵观整个实验，本研究还存在一些不足之处，如王不留行的质量指标选择较少，未能从多成分、多指标的角度进行深入研究，希望本研究能为王不留行的深入研究提供参考。