喀斯特地区土壤丛枝菌根真菌群落对岩性和人工造林的响应

2022-04-27陈优肖丹郑生猛胡亚军王小利何寻阳

农业现代化研究 2022年2期

陈优，肖丹，郑生猛，胡亚军，王小利，何寻阳*

（1. 贵州大学农学院，贵州贵阳 550025；2. 中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态过程重点实验室，湖南长沙 410125；3. 中国科学院环江喀斯特生态系统观测研究站，广西环江 547100；4. 武夷学院生态与资源工程学院福建武夷山 354300）

自上世纪90年代实施“退耕还林”等生态恢复工程以来，我国西南喀斯特地区植被恢复取得较好成效，石漠化趋势得以初步遏制[1-2]。人工造林在喀斯特地区大面积复绿中发挥了重要作用，也为我国实施“固碳减排”的行动做出了贡献[3]。但另一方面，单一人工林也存在弊端，常会导致土壤质量下降。目前人工林经营面临着如何维持造林效益、保障其可持续性等困难。而充分发掘土壤有益微生物资源，将其用于改善人工林土壤质量，可能是破题的关键。

丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）在陆地生态系统中分布广泛，能够与80%以上的高等植物形成互惠共生体[4]。AMF具有广泛的生态功能，如促进植物对养分（特别是磷）的获取[5]、土壤团粒的形成和土壤水分的保持[6-7]等。土壤AMF在促进退化土壤生态恢复中具有重要的应用潜力[8]，已被广泛应用于荒漠、盐碱地、矿山等生态系统修复中[9]。大量的科学证据表明，AMF可以显著改善土壤性质，增加地上和地下生物多样性，提高乔、灌木幼苗在水分和养分胁迫下的生存、生长和种群构建能力[9]。干旱胁迫下，接种丛枝菌根真菌能够有效促进喀斯特乡土树种（任豆）幼苗根、茎生长，提高植株的抗旱能力[10]。另一盆栽试验证实，AMF能显著促进喀斯特地区造林树种（青冈栎）地上部生长，提高植株对土壤水分和矿质元素吸收[11]。就AMF接种效果而言，本地真菌要优于外来真菌，组合菌群比少数种或单一种更好[9]。因此，未来将AMF应用于改善人工林土壤、提升造林效益具有可观的应用前景。而了解土壤AMF群落对不同岩性条件下土壤造林的响应则是将其合理利用于可持续人工林经营管理的重要前提。

我国西南喀斯特地区具有独特的地形地质背景，其岩溶作用强烈，土层浅薄且不连续，土壤由不同母岩发育而成[12-14]。成土母岩决定了发育土壤的物理化学性质（如土壤质地、pH）的差异[15]，进而会影响到土壤AMF群落特征[16-17]。人工造林主要是改变了土壤AMF生存所需的水分、养分等微生境，也会对AMF群落多样性产生影响[18]。但喀斯特地区岩性和人工造林对土壤AMF群落影响的相对重要性，以及两者是否存在交互作用目前尚不明确。本研究以我国西南喀斯特两种典型母岩（石灰岩和碎屑岩）人工林土壤为研究对象，探讨不同岩性条件下人工造林对AMF群落的影响。为合理利用土壤AMF用于退化地区的人工造林生态恢复模式提供理论基础。

1 研究区概况

研究区位于广西壮族自治区河池市都安县（23°47′～24°35′N，107°51′～108°30′E）。该区属亚热带季风性气候，年平均气温为19.6～21.6 ℃，1月最低（12.2 ℃），7月最高（28.6 ℃）。年平均降水量为1 726 mm，具有明显的季节模式，其中4～9月是雨季。地势西北高、东南低，地貌景观奇特，是全国岩溶地貌发育最为典型的地区之一。成土母岩主要为石灰岩，根据联合国粮农组织/联合国教科文组织的分类体系，石灰岩之上为钙质岩石土（石灰岩土），碎屑岩之上为铁铝土（红壤）。

2 研究方法与数据分析

2.1 样地遴选和样品采集

在本研究中，取样区域主要成土母岩为石灰岩和碎屑岩。研究区域由于岩性不同，其适生树种也存在差异，人工林种植树种多样，并不统一，因此本研究仅考虑人工造林而非种植树种的影响。采用空间序列代替时间序列的方法，石灰岩区选取种植15 a的任豆（Zenia insignis）、香椿（Toona sinensis）和板栗（Chestnut）人工林为研究对象；碎屑岩区选取与石灰岩区同样种植年龄的松树（Pinus）和杉树（Fir）人工林为研究对象，耕地（玉米地）作为参考。土壤采样时间为2015年3月底至6月初。在每个采样点选取20 m×30 m区域，每个小区随机采集10～15个土芯（深0～15 cm，直径5 cm），混合成一个复合样品。经四分法取约150 g，用锡箔纸包住，放入灭菌袋，投入液氮罐中冷冻，立即送回实验室，置于-70 ℃冰箱备用。剩余土样装入袋中，带回实验室用2 mm网筛筛去根、石屑等，风干，用于常规理化指标测定。

2.2 土壤理化性质测定

土壤理化性质测定参考鲍士旦[19]的方法，用pH计测定土壤pH值（土水比1∶2.5）；采用重铬酸钾氧化法测定土壤有机碳（soil organic carbon，SOC）；氮元素分析仪（EA3000；EuroVector，意大利）测定土壤全氮（total nitrogen，TN）；采用H2SO4+HClO4溶液酸消化法测定土壤全磷(total phosphorus，TP)；采用火焰光度法测定土壤全钾(total potassium，TK)；采用钼锑抗比色法(Olsen法)测定速效磷(available phosphorus，AP)；采用激光粒度仪Mastersizer 2000 (Malvern Instruments, Malvern, England)测定土壤机械组成；在pH 7.0条件下，用1 mol/L乙酸铵置换可交换性钙和镁，并采用电感耦合等离子体原子发射光谱 (ICP-AES)对其进行分析。

2.3 DNA提取和PCR扩增

从-70 ℃冰箱中取出经冷冻干燥后的土壤样品0.5 g，使用土壤DNA快速提取专用试剂盒（Fast DNA®SPIN Kit for Soil, MP）提取土壤总DNA（具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行）。用核酸检测仪和12 g/L的琼脂糖凝胶电泳分别检测DNA浓度及质量，并记录每个样品的DNA浓度及A260/A280、A260/A230信息。确定样品质量完全符合后续试验要求后，将样品进行分装，保存备用。

2.4 高通量测序

本文选用巢式PCR，第1对扩增引物为AML1/AML2（5'-3'序列，AML1：ATCAACTTTCGATGGT AGGATAGA；AML2：GAACCCAAACACTTTG GTTTCC），目的片段长度在500 bp左右；第2对扩增引物是AMV4.5NF/AMDGR（5'-3'序列，AMV4.5 NF：AAGCTCGTAGTTGAATTTCG；AMDGR：CCCAACTATCCCTATTAATCAT），目的基因片段长度约250 bp。所需引物均由上海英潍捷基贸易有限公司合成。巢式PCR第1步的扩增体系为20 μL，其中DNA模板1 μL，上游和下游引物各0.5 μL，2×PCR Ex Taq（TaKaRa，Japan）10 μL，ddH2O补至20 μL。扩增程序：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃30 s、退火58 ℃ 45 s、延伸72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min；保温4 ℃。第2步扩增体系为20 μL，其中模板（将第1步PCR产物稀释50倍）1 μL，上游和下游引物各0.5 μL，2×PCR Ex Taq（TaKaRa，Japan）10 μL，ddH2O补至20 μL。扩增程序：预变性94 ℃ 3 min；变性94 ℃ 45 s、退火60 ℃ 45 s 、延伸72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min；保温4 ℃。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，将得到的PCR产物按测序公司的送样包装要求（放入2 ml灭菌离心管中，并在离心管上标记对应样品编号）保存[20]，送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行测序。

2.5 数据分析

使用SPSS 22.0和Microsoft Excel 2019进行数据统计分析，数据在分析之前进行了正态性检验。采用独立样本T检验比较土壤理化变量、AMF群落多样性以及属水平上的相对丰度在石灰岩与碎屑岩、人工林与耕地间的差异。岩性与人工造林间的交互作用采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）进行。运用R软件进行AMF香农多样性指数和均匀度指数计算。采用Canoco 5进行冗余分析（RDA），探讨土壤理化性质对AMF属水平上的相对丰度、多样性以及群落特征的影响。采用Amos软件构建结构方程模型，分析岩性、人工造林、环境因子对AMF群落特征的作用机制。其中AMF群落特征由所有OTU进行NMDS分析，用降维后结果的第一轴表征。采用Origin 2018作图。

3 结果与分析

3.1 石灰岩和碎屑岩土壤理化性质变化特征

由表1可以看出，在石灰岩土壤中，人工造林显著降低了土壤有机碳、全磷和速效磷含量；碎屑岩土壤中，人工造林增加了土壤全钾含量，降低了土壤交换性钙、交换性镁、速效磷和黏粒含量（p<0.05）。同一利用方式下，全磷、交换性钙含量和pH值在石灰岩土壤中均显著高于碎屑岩。耕地土壤有机碳和砂粒含量在石灰岩较高，而石灰岩全钾和黏粒含量却显著低于碎屑岩。在人工造林条件下，石灰岩土壤全氮和交换性镁的含量显著高于碎屑岩土壤（p< 0.05），而有机碳和土壤质地在二者之间的差异因人工造林这一措施而减弱。根据全国土壤养分分级标准，喀斯特地区耕地土壤速效磷含量处于中上水平（10 ～ 20 mg/kg），人工造林使土壤速效磷含量降至低（3 ～ 5 mg/kg）或极低（< 3 mg/kg）水平，表明在喀斯特地区退耕地进行人工造林均显著降低土壤速效养分磷含量。

表1 石灰岩和碎屑岩地区土壤理化特征Table 1 Soil physicochemical properties of limestone and clasolite region

3.2 土壤丛枝菌根真菌群落组成

如图1所示，石灰岩和碎屑岩土壤中AMF群落在属水平上可鉴定为7个主要的共有属，包括球囊霉属（Glomus）、近明球囊霉属（Claroideoglomus）、无梗囊霉属（Acaulospora）、类球囊霉属（Paraglomus）、多样孢囊霉属（Diversispora）、盾巨孢囊霉属（Scutellospora）以及原囊霉属（Archaeospora）。球囊霉属占所有土壤样品的58.50%～89.37%，是调查区优势属，近明球囊霉属次之。其他属包括巨孢囊霉属（Gigaspora）、两性囊霉属（Ambispora）、雷德克囊霉属（Redeckera）及内养囊霉属（Entrophospora）。其中，巨孢囊霉属仅在石灰岩耕地（0.02%）和碎屑岩人工林（0.01%）中被发现；两性囊霉属和雷德克囊霉属分别在石灰岩和碎屑岩人工林土壤中未被发现；内养囊霉属仅存在于碎屑岩耕地土壤中（0.01%）。

图1 石灰岩和碎屑岩区土壤AMF群落在属水平结构的相对丰度Fig. 1 Relative abundance of arbuscular mycorrhizal fungal community in soils under limeston and clasolite region at genus level

在石灰岩区进行人工造林并未显著改变土壤AMF群落组成；在碎屑岩区进行人工造林显著增加了球囊霉属相对丰度，却显著降低了近明球囊霉属和类球囊霉属的相对丰度。表明喀斯特地区土壤AMF球囊霉属的生态适应性极强，在碎屑岩区进行人工造林更加有利于其生长和繁殖，非优势属的生长则受到不同程度的抑制作用。同一利用方式不同岩性间比较，石灰岩区耕地土壤无梗囊霉属相对丰度显著低于碎屑岩耕地；人工造林条件下，石灰岩区土壤近明球囊霉属的相对丰度显著高于碎屑岩（表2）。说明石灰岩和碎屑岩区土壤AMF群落组成存在的差异在进行人工造林后有所变化。

表2 石灰岩和碎屑岩区土壤AMF群落属水平的差异Table 2 AMF community compositions at the genus level between limestone and clasolite region

3.3 土壤丛枝菌根真菌多样性

去除嵌合体和与AMF不匹配的序列后，所有土壤样品共得到42 888条优质序列。将这些序列聚类为OTUs（相似度为97%），其数量表示AMF的物种丰富度。AMF物种丰富度的平均数在石灰岩耕地与人工林分别为96和105，碎屑岩耕地与人工林分别为98和96，不同类型土壤间无显著性差异。同一利用方式下，石灰岩区人工林土壤AMF香农多样性指数和均匀度指数均显著高于碎屑岩区人工林（图2a、2b）。石灰岩区进行人工造林后使土壤AMF多样性有增加的趋势，其中香农多样性指数达到显著水平。表明石灰岩区进行人工造林能够提高土壤AMF多样性，使AMF群落更加稳定；碎屑岩区进行人工造林并没有改变土壤AMF多样性，进一步说明了石灰岩区土壤AMF多样性对生态恢复的响应更敏感。

图2 土壤AMF香农多样性指数 (a) 和均匀度指数 (b)Fig. 2 Shannon diversity index (a) and Evenness index (b) of arbuscular mycorrhizal fungal

3.4 土壤丛枝菌根真菌群落的影响因素

双因素方差分析结果（表3）显示，岩性显著影响AMF多样性（p< 0.01）和多样孢囊霉属的相对丰度（p< 0.05）。人工造林对球囊霉属和近明球囊霉属相对丰度影响显著（p< 0.01）。两者对AMF多样性无交互作用，但对球囊霉属、近明球囊霉属、类球囊霉的相对丰度存在显著的交互作用（p< 0.05）。

表3 岩性和人工造林对AMF多样性及群落的双因素方差分析Table 3 Effect of lithology and afforestation on arbuscular mycorrhizal fungi diversity and community by two-way ANOVA

RDA分析表明（图3a），第1、第2排序轴能够在累计解释石灰岩与碎屑岩土壤AMF群落在属水平结构相对丰度变异的47.1%，交换性钙（F=3.0，p=0.009）和交换性镁（F=2.2，p=0.035）是主要的影响因子。球囊霉属的相对丰度与土壤有机碳、全磷、全钾以及砂粒含量呈正相关且相关性较弱，与速效磷和黏粒含量呈负相关；近明球囊霉属则与之相反。多样孢囊霉属与pH、全氮、全磷、有机碳及交换性钙含量呈正相关，与速效磷、黏粒及全钾含量呈负相关关系；类球囊霉属与交换性钙、交换性镁呈正相关，与全钾呈负相关。环境因子分别能够解释土壤AMF多样性和群落特征71.48%和27.42%的变异，其中土壤pH和速效磷含量是影响AMF群落特征的关键因子（图3b、3c）。

图3 土壤理化性质对AMF优势属的相对丰度(a)、多样性(b)以及群落特征 (c) 的影响Fig. 3 The influence of soil physicochemical properties on the relative abundance of dominant genus (a), diversity (b) and community characteristic (c) of arbuscular mycorrhizal fungal

结构方程模型（SEM）分析得到一个比较好的拟合关系（χ2=1.82, df=4,P=0.77, RMSEA=0.000,GFI=0.96），能够解释AMF群落88%的变异（图4）。从模型的路径系数可以看出，岩性通过影响pH、人工造林通过改变速效磷含量分别作用于AMF群落（图4），进一步突显了土壤pH和速效磷含量对AMF群落特征的重要性。

图4 基于影响AMF群落特征的关键因子构建结构方程模型Fig. 4 Structural equation model of key factors affecting arbuscular mycorrhizal fungal community characteristic

4 讨论

4.1 岩性对土壤丛枝菌根真菌群落的影响

岩性作为陆地表面的关键组成部分，是影响土壤性状的主导因素。由不同母岩发育的土壤，其理化性质如pH、有机碳、全磷、全钾、交换性钙含量及其机械组成等会表现出不同程度的差异，进而可能引起土壤AMF群落的变化。本研究发现，人工林土壤AMF群落香农多样性指数和均匀度指数在石灰岩高于碎屑岩（图2），这可能与两种岩性间土壤pH和氮、磷等养分存在差异有关。不论是耕地还是人工林，石灰岩土壤pH均显著高于碎屑岩土壤（表1），而土壤pH对微生物群落的作用已在诸多的研究中得到证实[21-22]。土壤pH会影响菌丝生长、孢子萌发，改变菌根侵染率，导致AMF的分布受到影响[21]。邱江梅等[22]研究表明，土壤pH与AMF香农多样性指数呈显著正相关关系。最近研究表明，岩性还可以通过影响地上植物养分资源获取策略，作用于菌根-植物共生体，进而影响到AMF群落特征[23]。梁月明等[24]研究结果也表明，岩性主要是通过影响植物与土壤养分来影响土壤AMF群落组成结构及丰度。

本研究中，岩性对AMF的群落组成作用并不突出，除了无梗囊霉属外，AMF其他优势属在不同岩性间无显著差异。球囊霉属是研究区两种岩性中的绝对优势属，占所有土壤样品的58.50%～89.37%。大量研究认为，球囊霉属生态适应性极强，是诸多生态系统的优势属[25-28]，能够支持本研究结果。球囊霉属能广泛分布于不同pH的土壤中，尤喜在碱性和中性土壤中生长[29]。魏源等[30]对喀斯特地区丛枝菌根真菌遗传多样性的研究表明球囊霉属极有可能是喀斯特地区AMF的优势菌属。Likar等[31]研究喀斯特土壤中的AMF多样性及其分布，同样发现球囊霉属是喀斯特生境中稳定存在的优势属。而无梗囊霉属在石灰岩耕地土壤中显著低于碎屑岩耕地，这可能与岩性所导致的土壤pH差异有关。张美庆等[32]对我国北方泡囊丛枝状（VA）菌根真菌的生态分布研究结果表明无梗囊霉属多存在于酸性土壤。综合说明喀斯特地区不同岩性对土壤丛枝菌根真菌群落的影响主要通过pH来调控。

4.2 人工造林对土壤丛枝菌根真菌群落的影响

人工造林会改变土壤理化性质如速效磷、全钾及黏粒含量，进而会间接影响AMF群落组成结构和多样性。本研究中，在碎屑岩区进行人工造林显著增加了球囊霉属相对丰度、降低了近明球囊霉属和类球囊霉属的相对丰度（表2），而石灰岩区土壤中AMF群落组成并未受到人工造林的显著影响；说明碎屑岩区土壤AMF群落结构对人工造林的响应更敏感。不同属对人工造林的响应表现出差异，可能与它们各自的生境偏好有关。碎屑岩人工造林显著增加了球囊霉属相对丰度，可能与球囊霉属具有极强的环境适应能力且有着独特的繁殖特性有关[33-34]；造林降低土壤黏粒含量，改善了土壤通气性，更有利于球囊霉属而非近明球囊霉属的生长[35]。造林导致近明球囊霉属相对丰度降低可能是近明球囊霉属对速效磷的需求较高（本研究中近明球囊霉属与速效磷呈正相关关系），而人工造林显著降低了速效磷含量，故而导致其相对丰度下降。因此，在碎屑岩区进行人工造林能够使得球囊霉属的优势地位更为突出，而部分非优势属却受到抑制。

值得注意的是，在石灰岩和碎屑岩地区进行人工造林恢复生态系统的措施，会使AMF的一些非优势属消失：石灰岩造林导致巨孢囊霉属和两性囊霉属消失，碎屑岩造林导致雷德克囊霉属和内养囊霉属消失。此外，在碎屑岩地区进行人工造林有助于巨孢囊霉属的出现，说明喀斯特地区进行人工造林将会改变土壤AMF群落组成，对于不同岩性土壤其群落组成的变化有所差异。

石灰岩地区进行人工造林显著增加土壤AMF香农多样性指数，可能与人工造林降低了土壤有机碳、全磷及速效磷含量有关。研究表明，土壤有机碳含量较高时，AMF的伴生微生物有可能因获得更多营养而大量繁殖，进而抑制AMF对根系的浸染[36]。土壤中速效磷含量与AMF多样性呈负相关关系[37-39]，可能是由于植物在低磷土壤中高度依赖AMF获取磷所导致[40]。另外，本研究中两种岩性条件下耕地进行人工造林之后土壤速效磷含量均处于较低水平[41]，缺磷的环境可能会刺激AMF的生长和代谢。而在碎屑岩地区进行人工造林并未显著改变土壤AMF多样性指数。因此，在喀斯特地区进行人工造林生态恢复措施会改变土壤养分（特别是速效磷）从而间接影响AMF群落结构和多样性，但其影响受制于岩性。综上，本研究认为，在喀斯特地区进行人工造林对土壤AMF群落的影响依赖于岩性的调控，土壤pH和速效磷是决定AMF群落的关键因子。