基于SSR-HRM技术的向日葵DNA指纹图谱构建

刘苡含，牟青山，陈珊宇，阮关海，胡 晋，关亚静，*

(1.浙江大学 农业与生物技术学院，浙江 杭州 310058； 2.海南浙江大学研究院，海南 三亚 572025； 3.浙江省农业科学院 作物与核技术利用研究所，浙江 杭州 310021)

向日葵(L.)属菊科向日葵属，一年或多年生，是仅次于大豆、低芥酸菜籽和花生的世界第四大油料作物，目前在世界各地广泛种植。同时，它还是一种重要的观赏性植物，其花穗、种子皮壳和茎秆可作为饲料或工业原料，花穗亦可供药用，种子可供食用。我国有丰富的向日葵种质资源，主要种植区分布于东北、华北和西北的半干旱或轻盐碱地区。近几年，向日葵作为“美好作物”被江浙一带引进，在美丽乡村建设中发挥重要作用。但随着我国新审定和从国外引进的向日葵品种越来越多，市场上品种混杂、假冒伪劣种子频现和品种侵权的现象屡见不鲜，且很多品种间存在性状相似、命名混乱的状况。因此，为有效区分不同品种与真伪种子，有必要对向日葵品种进行遗传多样性分析并开展DNA指纹图谱构建工作。

种质鉴定的方法有很多，传统的鉴定方法一般采用田间种植鉴定，占地面积大、费时费工、受种植地光温条件限制，而且向日葵的表型性状复杂，田间表型性状鉴定品种难以在短时间内完成。DNA指纹图谱鉴定技术是目前较为先进的遗传标记系统，它能直接从DNA水平上反映生物个体之间的差异，具有简单稳定、变异性高、位点丰富、专一性高、特异性强等优点。简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)标记因具有共显性、多态性丰富、稳定性高、操作简单可靠等优点，已广泛应用于水稻、花生、玉米、棉花、小麦、甘蔗等作物的品种真实性检测、遗传多样性分析和DNA指纹图谱构建中。目前，SSR扩增产物的检测方法主要采用聚丙烯酰胺-银染法，虽然此方法灵敏度和分辨率高、操作简单，但难以读取扩增片段大小，且在分析的材料和位点较多、片段差异较小时，数据的准确性会降低。高分辨率熔解曲线分析技术(high-resolution melting curve analysis，HRM)依靠核酸分子片段大小、GC含量等物理性质能够准确有效地区分SSR位点与不同基因型，识别产物片段中极小的碱基差异，是一种分辨率高且成本相对较低的DNA检测技术。本研究将SSR分子标记和HRM技术相结合，对向日葵的基因型进行快速鉴定，并使用非加权组平均法(unweighted pair group method with arithmetic averaging，UPGMA)对SSR-HRM原始数据进行聚类分析计算，依据分析结果构建DNA指纹图谱，以期为建立浙江省向日葵主栽品种的真实性和纯度鉴定体系，以及向日葵育种研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的32份向日葵种质资源搜集于浙江省各县市，由浙江省农业科学院提供。种质编号、名称、类型、特性与来源信息见表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取与纯化

从每个向日葵样品中随机取10颗种子播种，在合适的光温条件下土培至长出真叶，时间约2周。取真叶约0.5 g，液氮环境下使用组织磨样机研磨。采用CTAB法提取样品中总DNA。经琼脂糖凝胶电泳检测后，用NanoDrop1000分光光度计检测所提取DNA的纯度和浓度，原液置于-20 ℃保存，工作液DNA调整终浓度为100 ng·μL，作为模板用于后续试验。

1.2.2 SSR引物

查阅已公开发表文献中引物的多态性和扩增情况，结合位点的DNA序列，设计并合成了95对候选SSR引物。

1.2.3 SSR-HRM引物筛选

根据材料特性和来源随机抽取5份向日葵DNA材料(编号分别为2、7、15、24、31)进行引物筛选。PCR反应体系为20 μL：10 μL 2×PCRMasterMix (Vazyme)，2 μL模板DNA，上、下游引物(10 μmol·L)各1 μL，6 μLddHO；反应程序为95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，35个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存；采用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，设置电压为200 V，电流为160 mA，电泳2 h左右，经快速银染显影后读取条带。选取条带清晰、多态性稳定的引物用于SSR-HRM分析与DNA指纹图谱构建。

1.2.4 SSR-HRM的反应体系和程序

SSR-HRM采用Touchdown快速PCR程序连同高分辨率熔解曲线的分析方法，以提取的32份向日葵DNA为模板，利用筛选出的17对核心SSR标记引物，在Light Cycler 480Ⅱ型实时荧光定量PCR仪上进行PCR扩增与熔解曲线分析。PCR反应选用LightCycler480HighResolution Melting Master Mix，体系为20 μL：Mix10μL，模板DNA 2 μL，上、下游引物各0.4 μL(10 μmol·L)，dd HO 7.2 μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性10 min；95 ℃(20 s)，62～50 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，55个循环，退火温度从第一个循环62 ℃开始递减，每个循环减1 ℃直到50 ℃不再变化；HRM程序为：95 ℃变性60 s，立刻冷却至40 ℃保持60 s，接着从65 ℃开始以0.02 ℃·s的速度升至97 ℃。每板跑32个DNA样品，用1对引物，每个样品3次生物学重复。

表1 三十二份向日葵种质资源信息

1.2.5 SSR-HRM数据分析

待反应程序结束，使用LightCycler96(Version 1.1.0.1320 Roche Applied Science，Mannheim，Germany)分析原始数据，分析时将delta Tm discrimination和curve shape sensitivity参数分别调至50%，得到每对引物反应下32份向日葵材料的基因分型结果并记录，重复性差的样品记为“0”。

1.2.6 向日葵亲缘关系分析

分析17对SSR引物对应的高分辨率熔解曲线，得出基因分型结果，然后导入NT-SYS 2.10e软件，采用非加权组平均法分析所有样品的亲缘关系，构建聚类树。

2 结果与分析

2.1 引物筛选结果

大部分引物均能扩增出清晰整齐、多态性高的条带，仅8对引物无扩增产物。根据引物筛选结果，选用条带清晰、多态性稳定的17对引物用于32份材料的SSR-HRM分析与DNA指纹图谱构建。筛选出的17对核心引物的扩增结果见图1，引物信息见表2。

2.2 基于SSR-HRM的遗传关系分析

32份向日葵种质的高分辨率熔解曲线分析结果表明，标记ORS543、ORS665、ORS229和ORS1114的多态性较好。以标记ORS665的SSR-HRM分析结果为例，32份向日葵样品的高分辨率熔解曲线均有差异，根据熔点等的不同，样品被分成7个基因型组别，每组的高分辨率熔解曲线在形状上明显不同(图2-A)；结合差异图(图2-C)得到32份向日葵样品的基因分型结果(图3)。7组的代表品种分别是YK18-10、YK18-13、龙赏葵5号、YK18-9、S117、S116和S144，将它们的熔解曲线和差异图单独列出，可以更加清晰地观察到各基因型组别间的差异(图2-B和图2-D)。其余16对SSR标记的分析结果与标记ORS665类似，且均可有效区分供试的32份向日葵品种。根据17对SSR标记对32份向日葵样品的基因分型结果，构建了DNA数字指纹图谱(表3)。

2.3 基于SSR-HRM的聚类分析结果

M，DNA 2000 marker；ORS543、ORS456等为引物名称；图片中品种从左至右依次为油葵T777、YK18-11、龙赏葵5号、观赏S8、S117。M， DNA 2000 marker; ORS543， ORS456， etc. were the name of primers. The order from left to right represented oil sunflower T777， YK18-11， Longshangkui No.5， Ornamental sunflower S8 and S117.图1 核心引物筛选结果Fig.1 Screening result of core primers

表2 十七对SSR引物信息

A，32份向日葵种质资源的差异图，颜色相同的线为同一基因型组；B，7个基因型分组中各代表品种的差异图；C，32份向日葵种质资源标准化高分辨率熔解曲线图；D，7个基因型分组中各代表品种的标准化高分辨率熔解曲线图。A， Difference plots of 32 sunflower germplasm resources， and the same line color indicates the same genotype calculated by HRM analysis; B， Difference plots of the seven distinguished sunflower germplasm resources; C， Normalized HRM melting curve of 32 sunflower germplasm resources; D， Normalized HRM melting curve of the seven distinguished sunflower germplasm resources.图2 ORS665分子标记对32份向日葵种质资源的SSR-HRM分析结果Fig.2 SSR-HRM analysis of 32 sunflower germplasm resources with the SSR marker ORS665

图3 ORS665对32份向日葵样品的基因分型结果Fig.3 Genotype group of 32 sunflower germplasm resources with SSR marker ORS665

采用UPGMA法对SSR-HRM分型结果进行聚类分析，结果表明，17对引物可有效区分32份向日葵材料(图4)，32份向日葵样品在遗传相似系数为0.20处被分为两大类群，分别记为A、B。其中，来自美国的观赏型紫色向日葵(Purple sunflower)独立组成B类群，它与A类群中同为观赏型的红晕向日葵(Red sunflower)和多头向日葵(Multipoint sunflower)亲缘关系最近，与来自河北的油用型品种油葵M985(Oil sunflower M985)亲缘关系最远。A类群分为多个亚类群，同一类型或相同地理来源的向日葵材料多聚类在一簇；不同类型和地理来源的材料间聚类相对较分散。14种油用向日葵材料中，来自吉林、黑龙江的大部分材料亲缘关系较为接近，说明其在育种上很可能存在性状相似、亲本来源较为狭窄的问题；13种观赏型向日葵材料间遗传多样性最高，其亲缘关系与地理来源无明显相关，说明国内外向日葵种质资源间具有丰富的遗传多样性；5种食用型向日葵材料亲缘关系与地理来源相关性一般，遗传多样性相对较高，但可能存在样本量小、不具有代表性的问题。

表3 三十二份向日葵材料的数字化指纹图谱

图4 三十二份向日葵品种基于SSR标记的聚类图Fig.4 Dendrogram of 32 sunflower cultivars based on SSR analysis

3 结论与讨论

我国存在向日葵传统地方品种老化、种植良种混杂、育成品种稀缺等问题，亟需进行种质筛选鉴定与创制工作。一个准确、快速、高效的分子鉴定技术对向日葵的品种鉴定具有重要意义。近年来，随着现代生物技术的不断发展，DNA指纹图谱在种质鉴定中发挥越来越重要的作用。SSR分子标记是构建DNA指纹图谱的首要选择，HRM技术在构建遗传指纹图谱等领域的应用也有较大的拓展。国内外已有大量学者将SSR与HRM技术融合应用于植物的品种鉴定。Pereira等将HRM技术应用于橄榄油和葡萄酒的真实性鉴定。An等将自主开发的丝瓜基因组SSR分子标记与高分辨率熔解曲线融合，成功应用于丝瓜的基因型分析。殷豪等在西洋梨中的研究也证明，HRM技术是SSR标记分型的有效手段。陈媞颖等应用HRM技术对已知的7对SSR引物进行筛选，为金银花种质鉴定做出贡献。赵均良等验证了HRM技术应用于水稻SSR、InDel和SNP标记基因型分析的可行性和可靠性。

本文基于SSR分子标记技术，对32份向日葵种质资源进行高分辨率熔解曲线分析和聚类分析。筛选出的17对可以有效区分32份向日葵样品的SSR引物，且聚类结果与样品的地域来源、表型特征、亲缘关系基本一致，这说明SSR-HRM技术在向日葵基因分型和种质资源的鉴定中是可靠的。32份向日葵种质资源中，同类型和同来源的材料间亲缘关系较为接近，也有部分不同类型、不同来源的材料间遗传相似系数较大，说明它们之间没有明显界限，推测其亲本来源可能较为狭窄，也间接说明SSR分子标记辅助向日葵育种是可行的。

在向日葵品种鉴定上，可以利用本研究筛选出的核心引物开展向日葵DNA指纹库的深入研究，建立完整的向日葵品种真实性和纯度鉴定体系。在向日葵核心种质创制方面，可以辅助利用SSR-HRM技术，避免重复无效育种，多拓宽亲本来源，多利用亲缘关系较远的野生种质和国外种质资源如紫色向日葵(观赏，美国)、富阳酸橙(观赏，日本)等，以提高向日葵育成品种的遗传多样性。