商丘地区番茄枯萎病病原菌分离与鉴定

孙景梅 朱晓琴 盛亚楠 裴冬丽

摘要：本试验以河南省商丘地区患枯萎病番茄植株为试材，采用组织分离、形态观察及ITS序列分析，对引起番茄枯萎病的病原菌进行鉴定。结果表明，病原菌菌落呈圆形、白色，中心呈淡紫色，分生孢子镰刀状或椭圆状。经PCR扩增番茄病原菌ITS序列后得到长度为582bp的片段，对该序列在NCBI中进行比对，显示与尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）同源性达99%以上。综合形态特征和序列比对结果，确定该病原菌为尖孢镰刀菌。将该病原菌回接到健康番茄植株上，引起番茄枯萎症状与田间一致。

关键词：商丘市;番茄枯萎病;分离;鉴定;尖孢镰刀菌

番茄因其营养物质丰富，味道鲜美，加工方式多样，受到世界各国的喜爱。在中国，番茄栽培范围广、种植面积大，呈集约化栽培趋势。但番茄的集约化种植使病害发生愈加频繁[1]。番茄枯萎病是由枯萎病菌引起的一种维管束疾病，是一种严重危害番茄品质和产量的土传性病害，从番茄幼苗期到成株期均可侵染[2]。尤其连作及设施生产中该病害的发病几率更高，常在开花期侵染番茄茎基部造成维管束堵塞、植株萎蔫枯死，现已成为影响番茄栽培面积扩大和效益提升的重要病害之一[3]。据统计，发病危害严重的大棚减产达30%～50%，已成为设施番茄安全生产的主要瓶颈[4]。本试验以河南省商丘市平台镇千禧番茄为研究对象，通过对病原菌进行形态观察和ITS序列扩增对其进行鉴定[5]，以期为培育抗番茄枯萎病材料提供依据。

1材料与方法

1.1试验材料

供试植株为河南省商丘市平台镇千禧番茄。PDA培养基，在高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20mi

1.2试验方法

1.2.1番茄枯萎病的田间发病症状 于2019年和2020年的5—6月在河南省商丘市平台镇千禧番茄大棚内对番茄枯萎病的发生情况进行调查，每隔6d观察一次，直至全株发病枯死。

1.2.2番茄枯萎病病原菌的分离与纯化 病原菌的分离采用植物组织分离法[6，7]。首先将患病组织在75%乙醇中消毒20s，取出后用无菌水冲洗3次，再用5%次氯酸钠消毒5min，无菌水漂洗5次。使用最后一次漂洗的水進行涂布判断是否灭菌彻底。在超净工作台中用灭菌镊子将处理过的患病组织块（约5mm2）平铺于PDA培养基上，每个培养基4块。于27℃培养箱内倒置培养1周，观察菌株生长情况。待菌落长出后采用单孢分离法进行纯化[8，9]。

1.2.3番茄枯萎病病原菌形态观察 在进行单孢分离后，得到菌株的单菌落，观察和记录菌落的形态、分泌物及颜色变化;显微镜下观察孢子形状大小、有无分隔等。

1.2.4番茄枯萎病病原菌的DNA提取及ITS序列扩增 采用改良的CTAB法[10，11]提取番茄枯萎病病原菌的总DNA，利用通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′扩增菌株ITS基因片段。反应体系（20μL）：DNA2μL，ITS11μL，ITS41μL，dNTP1.6μL，10×PCRBuffer2μL，ddH2O11.9μL，Taq酶0.5μL。反应条件：94℃预变性3min;94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环;72℃延伸10min。PCR产物送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。1.2.5 病原菌的致病性检测 病原菌在PDA液体培养基中培养7d，制备孢子悬浮液，将孢子浓度调至106个/mL左右。选取长势一致的健康植株采用叶片喷洒法[12]接种病原菌，空白对照喷洒清水。25℃培养并注意保湿，观察植株发病状况。

2结果与分析

2.1番茄枯萎病症状

一般在番茄花期开始发病，发病初期番茄植株下部接近地面的叶片变黄，随着发病时间的延长患病叶片发黄直至枯萎，少部分植株会出现一侧叶片发病一侧正常的现象，大多植株都是除了最顶端几片叶正常外，其余叶片从下往上慢慢发病并发黄枯萎、但不会脱落，与曹俊库[13]的结果一致。

2.2番茄枯萎病病原菌菌落及孢子特征

本试验分离到多株病原菌，选取一株有代表性菌株进行后续试验，命名为FQ-1。培养8d时，从培养基正面看FQ-1菌落呈白色絮状，圆形，菌落边缘为稀疏的白色菌丝，边缘不整齐，向四周呈放射状生长（图1A）。从培养基背面看，菌落四周呈白色，中心则呈淡紫色，边缘不平整（图1B）。

病原菌孢子呈不同形状及大小，大孢子镰刀状，内部有0～3个横向隔膜，小孢子呈椭圆形（图1C、D）

2.3番茄枯萎病病原菌分子鉴定结果

PCR扩增ITS基因序列总长度为582bp，扩增产物测序后在NCBI核酸序列数据库中进行同源序列比对，结果表明扩增序列和尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）的序列（登录号：KP942940.1）相似性达99%、覆盖率为100%。依据中国真菌志（第三十八卷）[14]，结合菌株形态特征，确定商丘地区番茄枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌。

2.4番茄枯萎病病原菌的致病性检测

培养1周时接种后的植株陆续发病，且发病症状和田间枯萎病症状相同（图2B～F），而对照生长正常（图2A）。表明导致番茄枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌。

3讨论与结论

植物真菌性枯萎病是一种毁灭性土传病害，主要致病菌为尖孢镰刀菌，其寄主范围广泛，可侵染100多种植物[15，16]，有“植物癌症”之称[17，18]。该病原菌从植株根部侵入，侵染性极强[19]，是世界范围内许多作物的重要致病菌，因此病原菌的准确鉴定对防控作物枯萎病意义重大[20]。

本试验以河南省商丘市平台镇采集的发病番茄植株为试验材料，采用组织分离法对病原菌进行分离，并通过形态观察和分子测序对其进行鉴定。结果表明，引起番茄枯萎病的致病菌为尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）。对该致病菌的基因组信息有待进一步研究，另外，本试验主要在实验室中进行，为了试验结果的准确性，后续需在大田中作进一步研究，对所分离的病原菌生理生化特性进行分析，并筛选出相应拮抗菌，结合生产过程中棚内湿度调节、合理通风、合理轮作等措施有效预防番茄枯萎病的发生。