玉米ZmMYB2基因的克隆及表达分析

杨晓艺 王聪 鹿锦浩 吕绍芝 林海东 裴玉贺

摘要：为了研究MYB转录因子的功能及其对逆境胁迫的响应，本研究对玉米自交系辽3162三叶期幼苗进行干旱和盐胁迫处理，克隆ZmMYB2基因并进行生物信息学分析，探究该基因在胁迫条件下的表达。该基因开放阅读框长1233bp，编码410个氨基酸，具有多个MYB转录因子结合位点，为MYB转录因子。经生物信息学分析推测ZmMYB2蛋白分子量为46.08kDa，等电点为6.38，属于亲水性酸性非分泌蛋白，具有2个MYB保守结构域，定位在细胞核内，与高粱、南荻的亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明，该基因在玉米叶片中的表达量最高，具有组织特异性，且能响应干旱和盐等非生物胁迫。初步判断该基因对玉米的非生物胁迫应答起着重要作用。

关键词：玉米;ZmMYB2;基因克隆;胁迫应答;生物信息学分析;基因表达

MYB转录因子家族是一类DNA结合蛋白，在植物次生生长发育、细胞周期调控和抗逆生理等方面有着重要作用。1987年PazAres等从玉米中发现并克隆了植物中第一个参与花青素合成的MYB基因ZmMYB2C1[1]，此后随着研究的深入，越来越多的该家族成员被挖掘出来。MYB转录因子家族成员具有相似的结构，完整的MYB蛋白由三部分组成：MYB结构域、转录激活结构域和负调控结构域。MYB结构域位于MYB蛋白的N-末端，含有约52个氨基酸残基[2]。MYB蛋白通常包含1～4个保守的MYB结构域，根据MYB结构域的数量分为4类———1R-MYB、2RMYB、3R-MYB、4R-MYB[3]。其中2R-MYB中的R2R3-MYB蛋白是高等植物所独有的，由在N端高度保守的MYB域和在C端高度可变的C端域组成[4]，具有多种功能，是目前研究最广泛的MYB蛋白，仅在被子植物基因组中就有超过100个成员[5]。

尽管MYB蛋白显示出高度的结构相似性，但来自不同物种或生物体的相似蛋白之间却存在明显的功能差异。例如，在烟草中过表达BpMYB4可以诱导一些木质素生物合成基因的表达，导致次生壁增厚[6]。在拟南芥中过表达AtMYB75基因也会导致木质素积累的轻微增加，参与木质素生物合成的调控;AtMYB3R1和AtMYB3R4基因可以激活KNOLLE基因的表达，从而在核分裂中起到积极的调节作用;AtMYB88和AtMYB124基因可以控制细胞周期和细胞分化过程;AtMYB24、AtMYB57、AtMYB80等基因对花药和花粉粒的发育起重要作用[7]。RgMYB10基因能促进合成毛蕊花糖苷[8]，ZmMYB48能调控植物对干旱胁迫的防御[9]，ZmMYB268在植物抵御高温方面起重要作用[10]。

本研究以玉米自交系辽3162幼苗为试材，对ZmMYB2基因进行克隆并进行生物信息学分析，通过模拟盐胁迫和干旱胁迫，研究其在非生物胁迫下的表达情况，旨在为玉米抗逆育种提供基因资源，为探究MYB转录因子调控非生物胁迫的分子机制奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

取玉米自交系辽3162种植在青岛农业大学培养室内，培养条件为（25±2）℃、16h光照/8h黑暗、相对湿度70%，培养至三叶一心时进行盐和干旱胁迫处理，分别用250mmol/L的NaCl溶液和20%的PEG-6000溶液浇灌幼苗，分别在处理0、6、12、24、48h采集玉米幼嫩的根、茎、叶，于-80℃冰箱内保存备用。

1.2RNA提取及cDNA合成

使用TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit（TaKaRa公司），从三叶期幼苗组织中提取RNA。用超微量分光光度计（Nanodrop2000，美国）对提取的总RNA浓度和纯度进行检测，同时用1%琼脂糖凝胶电泳进一步检测RNA质量。采用HiScriptⅡQRTSuperMixforqPCR（+gDNAwiper）试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）进行cDNA第一链的合成。

1.3ZmMYB2基因的克隆

用PrimerPremier5.0软件设计引物。以反转录产生的cDNA为模板，利用高保真酶进行PCR扩增，对PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳后切胶回收;将目的条带与克隆载体pMD19-T进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，LB培养基复苏后筛选出多个阳性克隆，选择单菌落进行PCR扩增，选择扩增出目标条带的细菌溶液，送样测序。

1.4ZmMYB2的生物信息学分析

通过NCBI搜索获得基因基本信息，然后利用在线分析工具ExPASy、NetPhos3.1、SignalP4.1、SOPMA、TMHMM、PlantCARE等[11-15]对ZmMYB2蛋白的理化性质、磷酸位点、保守结构域、亚细胞定位、进化关系、二三级结构、启动子顺式作用元件等进行预测分析。

1.5荧光定量PCR

通过检索获得的ZmMYB2基因序列，设计cDNA快速扩增的上、下游引物（表1）。使用试剂盒ChamQTMUniversalSYBRqPCRMasterMix（南京诺唯赞生物科技有限公司）在荧光定量PCR仪（QuantStudio3，美國ABI）上进行荧光定量PCR扩增。采用2-ΔΔCt方法[16]计算ZmMYB2基因在幼嫩根、茎、叶中的相对表达量及处理0、6、12、24、48h的相对表达量。使用MicrosoftExcel2010处理数据并进行差异显著性分析和作图。

2结果与分析

2.1ZmMYB2基因的克隆及鉴定

根据基因序列设计全长编码区引物，以cDNA为模板对ZmMYB2进行PCR扩增，从玉米自交系辽3162中扩增出一条长度为1233bp的基因序列，用琼脂糖凝胶电泳对RNA和目的基因序列进行验证（图1），根据ORFfinder可知该基因编码410个氨基酸（图2）。

2.2ZmMYB2的启动子序列顺式作用元件预测分析

从NCBI数据库获得ZmMYB2基因的启动子前3000bp序列，使用在线软件plantCARE对启动子序列的顺式作用元件进行预测，结果（表2）发现，在ZmMYB2基因上游不仅有CAAT-box、TATA-box等常见的核心启动子元件，还发现了13个MYB转录因子结合位点，表明ZmMYB2具有启动子驱动的功能，可能受玉米MYB家族成员的调控。

2.3ZmMYB2蛋白的理化性质分析

利用在线软件ExPASy对ZmMYB2蛋白进行理化性质分析，结果（表3）显示，ZmMYB2蛋白分子式为C2003H3157N589O636S13，由20种常见氨基酸组成，含量最高的为亮氨酸（Leu），占总含量的9.8%，谷氨酸（Glu）和丝氨酸（Ser）次之，占总含量的8.5%，色氨酸（Trp）含量最低，仅占0.5%;理论等电点为6.38，小于7，表明ZmMYB2蛋白是一个弱酸性蛋白;亲水指数为-0.714，推测为亲水性蛋白。利用在线工具ProtScale分析得到玉米ZmMYB2蛋白的亲/疏水信号图（图3），其多肽链N端和C端皆表现为亲水性，中间部位多数也表现为亲水性，亲水峰值在-0.5以下的信号明显多于峰值在0.5以上的信号，进一步证明了ZmMYB2蛋白具有亲水性。

2.4ZmMYB2蛋白的磷酸位点、信号肽、结构域预测及亚细胞定位

通过在线软件NetPhos3.1分析可知，ZmMYB2蛋白可能存在46种磷酸化位点（图4），分別为28个丝氨酸（Ser）位点、12个苏氨酸（Thr）位点和6个酪氨酸（Tyr）位点，可以与磷酸基团结合，传递磷酸基团。利用在线软件SignalP4.1和TMHMM对ZmMYB2蛋白进行信号肽和跨膜结构域预测，结果显示ZmMYB2基因编码的蛋白中不存在信号肽和跨膜结构域，从而推测ZmMYB2蛋白为非分泌蛋白，是在细胞内起作用的蛋白。根据在线工具CDSearch，查找ZmMYB2基因的保守结构域，结果（图5）表明，ZmMYB2蛋白含有MYB-SHAQKYF和MYB-CC-LHEQLE两个MYB域，推测ZmMYB2蛋白属于MYB家族的转录因子。利用在线工具Plant-mPLoc对ZmMYB2蛋白进行亚细胞定位，结果表明ZmMYB2蛋白定位在细胞核中的可能性最大，推断ZmMYB2蛋白最有可能在细胞核中起作用，是能够与DNA特定片段结合调控下游基因表达的转录因子。

2.5ZmMYB2蛋白的二三级结构预测

利用在线工具SOPMA分析得知，ZmMYB蛋白的多肽链中多以无规则卷曲为主，含量为55.85%，其次为34.88%的α-螺旋，延伸链和β-折叠含量较少，各占7.07%和2.20%。利用在线工具SWISS-MODEL对ZmMYB2蛋白的410个氨基酸进行3D建模，模板覆盖率为62.07%，得到ZmMYB2蛋白的三级结构（图6）。

2.6ZmMYB2蛋白的序列对比和进化分析

利用在线工具DNAMAN6.0，以ZmMYB2基因序列为探针，按照最大似然法，将ZmMYB2蛋白序列与高粱（Sorghumbicolor）、南荻（Miscanthuslutarioriparius）、柳枝稷（Panicumvirgatum）、黍（Panicumhallii）、粟（Setariaitalica）、福尼奥小米（Digitariaexilis）、野生二粒小麦（Triticumdicoccoides）、籼稻（Oryzasativasubsp.indica）、大麦（Hordeumvulgare）等植物的MYB序列进行对比，结果（图7）显示MYB蛋白序列的重叠性较高，表明MYB转录因子具有较高的同源性，在进化过程中具有一定的保守性。采用DNAMAN6.0进行多序列比对，利用MEGA-X构建各植物蛋白的系统发育进化树（图8），发现ZmMYB2蛋白序列与高粱和南荻的MYB序列亲缘关系最近，同属高粱族，而与籼稻、野生二粒小麦和乌拉尔图小麦（Triticumurartu）的亲缘关系最远。

2.7ZmMYB2基因的表达分析

qRT-PCR分析ZmMYB2基因在不同组织中的表达，结果（图9）显示，ZmMYB2基因在玉米根、茎、叶中均有表达，但不同部位的表达量存在差异，根中的表达量最低，叶中最高，为根的3.88倍，茎中的表达量仅次于叶，为根的3.15倍，说明ZmMYB2基因的表达具有组织特异性。ZmMYB2基因在盐胁迫和干旱胁迫0～48h的表达水平变化情况如图10所示，可见，ZmMYB2基因的表达量在NaCl胁迫后呈现先降低后升高、处理48h后又显著下降的变化趋势;在模拟干旱处理下呈现升-降-升-降的波动趋势，在处理的12h后显著升高，24h时达到最高。推测ZmMYB2基因能够响应NaCl和PEG胁迫。

3讨论与结论

本研究从玉米中克隆出ZmMYB2基因，生物信息学分析结果表明该蛋白为弱酸性亲水性非分泌蛋白，定位在细胞核内;上游序列中含有多个启动子顺式作用元件，具有多个转录因子结合位点，包括MYB转录因子结合位点;含有MYBSHAQKYF和MYB-CC-LHEQLE两个保守结构域。说明ZmMYB2属于MYB转录因子家族。

本研究发现，ZmMYB2基因主要在玉米叶片中表达，其次为茎中，在根中的表达量较低。与前人研究结果类似，如澳洲坚果MiMYB2基因主要在枝叶中表达，在花中的表达量较低[17];地黄RgMYB10基因主要在须根中表达，在块根中的表达量较低[8]。Chen等利用拟南芥非生物胁迫反应MYB蛋白序列，通过比较基因组学，从玉米中鉴定到46个可能参与非生物胁迫的MYB基因，其中，转ZmMYB30基因能够提高拟南芥对盐胁迫的耐受性，并能增加非生物胁迫相关基因的表达数目[18];胡育峰等研究发现在胚乳中过表达MYB14能够提高玉米籽粒淀粉含量[19];TaMYB3R1、TaMYB1和TaMYBsdu1基因也在小麦干旱反应中起着重要作用，TaMYB2A、TaMYB3R1、TaPIMP1等基因通过抑制植物蛋白磷酸酶2C的表达来提高小麦耐盐性[20];TaMYBsm3基因通过提高P5CS1、DREB2A、RD29A等非生物胁迫应答基因的表达水平来增强小麦抗旱性[21]。本研究发现，盐胁迫和干旱胁迫均能使ZmMYB2基因表达量上调。综合上述分析，可推断MYB家族基因的表达具有组织特异性，并对植物抵御非生物胁迫起着重要的调控作用。

本研究结果可为进一步研究ZmMYB2基因的生物学功能以及玉米对非生物胁迫应答的分子机制奠定基础。