基于巨噬细胞可塑性的中药防治急性肺损伤的研究进展

袁静 夏金婵 郭晓琦 江华

河南中医药大学医学院（郑州450046）

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是一种以肺泡/毛细血管通透性增加、肺部炎症以及肺组织结构破坏为特征的呼吸系统疾病，其中急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是其发展的严重形式，主要临床表现为缺氧和肺顺应性降低，是临床常见的急危重症，病死率可达30% ～40%［1］。目前，治疗ALI/ARDS 在临床上尚无特效方法，因此为ALI 寻找更好的治疗靶点以降低病死率显得尤为重要。

巨噬细胞参与了ALI/ARDS 的整个发病过程，包括炎症反应的调节以及肺组织损伤的修复［2］。当大量细菌内毒素随血流进入肺部，巨噬细胞是最先启动的防御细胞，可分泌多种促炎/抗炎递质，参与肺部炎症反应。巨噬细胞具有高度可塑性，可根据不同微环境的刺激表现出多种功能表型［3］。其中，经典的巨噬细胞极化呈两种相反的表型状态：由细菌脂多糖（LPS）或与γ 干扰素（IFN-γ）联合刺激诱导的促炎M1 表型巨噬细胞以及由白介素-4（IL-4）等诱导的抗炎M2 表型巨噬细胞。在ALI/ARDS 病程中，炎症可导致巨噬细胞反应的异常重塑，并导致其表型的改变［2］。目前，越来越多学者研究发现中药复方及其活性成分能够通过调控巨噬细胞表型由促炎向抗炎方向转变，从而为临床防治ALI 提供新的理论参考。本文就巨噬细胞的起源、巨噬细胞可塑性的分子机制以及以中药调控巨噬细胞极化为靶点防治ALI 等方面研究作一综述，以期为探索ALI 的发病机制和防治ALI提供新的方向和思路。

1 巨噬细胞的起源

早期通过小鼠体内实验以及人类的器官移植等研究，发现了组织中的巨噬细胞来源于血液循环中的单核细胞［4-5］。在未受到变应原刺激时小鼠组织中的巨噬细胞并不是来源于血液中的循环单核细胞，例如大脑、皮肤、肝脏、肺等大多数脏器中的巨噬细胞来源于卵黄囊或胎肝［6］。目前多数研究表明，组织中巨噬细胞有双重来源，如成年小鼠心脏巨噬细胞是由发育过程中组织产生的细胞和循环血液中的单核细胞两部分组成［7］。与小鼠相比，集落刺激因子-1（CSF-1）诱导成熟的人巨噬细胞增殖较困难，因此推测人类组织中巨噬细胞主要来源于单核细胞，在机体受到外界刺激条件后作为重要的免疫细胞发挥抗感染、抗肿瘤、免疫调节等作用。另外，组织中巨噬细胞在机体生长发育过程中也发挥广泛的生理作用，例如在心血管系统中，组织巨噬细胞具有组成血管壁以及维持心率等功能［8］；在肝脏中，库普夫细胞参与胆固醇的外排，在脂质代谢过程中发挥重要作用［9］。因此，研究巨噬细胞的起源对于了解机体稳态、疾病发展进程具有重要意义。

2 巨噬细胞可塑性的分子机制

表观遗传学是指在不改变DNA 序列的情况下引起基因水平的变化，如组蛋白修饰、DNA 甲基化、非编码RNA（ncRNA）等。巨噬细胞的分化与激活以及炎症反应中巨噬细胞表型的改变也受以上表观遗传修饰的调控。

2.1 巨噬细胞分化及活化的表观遗传调控

2.1.1 组蛋白修饰 在细胞核中，DNA双螺旋紧密包裹在组蛋白周围，这种结构不利于转录因子与DNA 结合，而通过组蛋白修饰可实现染色质重塑，进而有利于相关基因的转录激活［10］。髓系干细胞中非活性增强子被谱系决定转录因子（LDTFs）PU.1 打开，并由H3K4me1 标记实现向巨噬细胞的分化过程，巨噬细胞中启动增强子在LPS 或IFN-γ刺激下，信号依赖转录因子（SDTFs）NF-κB 结合到ATAC-seq 使巨噬细胞向促炎的M1 表型活化；而STAT6 等SDTFs 在IL-4 诱导下向抗炎的M2 表型活化［11］。激活的转录因子招募组蛋白修饰酶（HMEs）进行磷酸化、甲基化、乙酰化等修饰，进而利于转录的激活或抑制。在启动子上，SDTFs 可直接与DNA 结合，RNA 聚合酶Ⅱ结合到开放的DNA 序列中使基因稳定转录［11］。

2.1.2 DNA 甲基化 DNA 甲基化是一种常见的表观遗传现象，通常发生在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸中的胞嘧啶第5 个碳原子上，并通过DNA 甲基转移酶（DNMTs）催化完成。大多数CpG 岛位于基因的启动子区域，当甲基化发生时，富集的DNA 结构阻止转录因子进入启动子区域，从而导致基因失活。在正常生理条件下，DNMTs维持CpG 位点的甲基化，使得一些转座因子的调控机制得以沉默［12］。研究［13］发现，单核细胞向巨噬细胞的分化与DNA 甲基化有关，但随后巨噬细胞的激活却很少有DNA 甲基化改变。

2.1.3 ncRNA ncRNA 通常不翻译成蛋白质，而在调节基因表达上起重要作用，如微小RNAs（miRNAs）和长非编码RNAs（lncRNAs）。研究表明，miRNAs 可影响巨噬细胞分化和激活程序，与炎症疾病的发病机制密切相关。JIANG 等［14］通过静脉注射负载miR-155 的血清外来体，可增加肺组织中M1 型巨噬细胞的数量，并引起未感染小鼠的肺部炎症。另外，lncRNAs 在调节巨噬细胞活化中也具有重要作用，SUN 等［15］研究认为，lncRNA生长抑制特异转录因子5（GAS5）能够抑制M2 型活化，进而抑制干扰素调节因子4（IRF4）转录，有望成为脱髓鞘疾病的潜在治疗靶点。而过表达GAS5 可抑制JAK2/STAT3 信号通路，促进M1 型巨噬细胞的极化［16］。

2.2 疾病中巨噬细胞表型的表观遗传调控 炎症与多种疾病有关，包括癌症、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、ALI 等。巨噬细胞作为炎症疾病中的第一道防线发挥重要作用。在疾病状态下，巨噬细胞向促炎表型分化，导致炎症反应增强，如ALI、COPD 等疾病中；巨噬细胞向抗炎表型分化时可导致免疫抑制以及防御能力下降，如癌症等疾病中。

2.2.1 内毒素耐受 巨噬细胞长期暴露于内毒素环境下，使其处于免疫抑制状态，对随后的内毒素呈低反应性，即内毒素耐受。巨噬细胞在首次接触内毒素时，炎症基因通过TLR4-TRIF-STAT3 途径被抑制，当机体再次遭受相同刺激时体内的炎症反应减弱，从而降低患者病死率［17］。从机制上讲，巨噬细胞中一些基因在多次接触LPS 后由于启动子上没有发生乙酰化，使其缺乏转录激活的条件而发生内毒素耐受［18］。研究认为，这种转录无法激活的现象主要是由于某些促炎转录因子（如IRF 和STAT2 等）或耐受诱导转录因子（如缺氧诱导因子1α 等）受抑制所致［19］。过度的免疫耐受可导致病理性的免疫抑制，如脓毒症。通过I-BET（一种干扰溴结构域与乙酰化组蛋白结合的药理学抑制剂）预处理巨噬细胞可阻止LPS 诱导的免疫耐受，而经β-葡聚糖处理后可恢复约60%的耐受基因的表达［19-20］，这些研究结果为临床治疗脓毒症提供了参考。

2.2.2 免疫训练 免疫训练是指巨噬细胞等固有免疫细胞经病原体初次刺激后可在短期内对病原体的再次刺激迅速产生较强的非特异性免疫应答的现象。与具有内毒素耐受的抗炎性巨噬细胞表型不同，另一些疾病具有促炎性巨噬细胞表型［21］。研究表明，表观遗传重编程在训练免疫过程中极其重要。在静息的巨噬细胞中，大多数促炎基因处于受阻构型阻碍了转录机制进入驱动促炎因子表达的调节区，在β-葡聚糖、卡介苗、氧化的低密度脂蛋白等刺激下能够增强该细胞对初次刺激物的二次刺激反应［22］；另外，免疫代谢重编程是训练免疫的又一发生机制，在动脉粥样硬化疾病患者的单核细胞/巨噬细胞中，葡萄糖的过度利用促进巨噬细胞分泌大量的促炎因子IL-6、IL-1β，驱动全身炎症的发生［23］。

3 ALI 中巨噬细胞的可塑性

ALI 是一种炎症性疾病，多种免疫细胞和肺实质细胞均参与了炎症反应的发生和发展，其中巨噬细胞是导致炎症疾病不断进展的重要免疫细胞之一，其活化促进了炎症的启动、放大和损伤的全过程。在ALI 发生发展过程中，通过微环境刺激不同的转录因子调控着巨噬细胞的表型改变。

3.1 参与细胞因子信号转导的转录因子

3.1.1 NF-κB NF-κB 家族的SDTFs 介导巨噬细胞的炎症反应。在未受刺激时，NF-κB 以非活性的形式存在于细胞质中，接触刺激条件后磷酸化进入细胞核，结合到DNA 上，而后招募组蛋白乙酰转移酶EP300，从而导致组蛋白乙酰化，转录被激活［24］。高迁移率蛋白1（HMGB1）是一种高度保守的核DNA 结合蛋白，可诱导机体发生严重的炎症反应［25］。研究表明，HMGB1 在ALI 和脓毒症的发病机制中起着重要作用。在ALI 病程中，活化的巨噬细胞分泌HMGB1 到细胞外环境，并且在其表面表达TLR2 和TLR4，向细胞内传递信号，进而促进NF-κB 的激活［26］，诱导巨噬细胞向M1 表型极化，并降低M2 表型巨噬细胞的百分比［27］。

3.1.2 STAT IFN-γ 促进巨噬细胞产生炎症介质，主要是通过STAT1 激活介导的。IFN-γ 与相应的受体结合触发STAT1 酪氨酸磷酸化，与细胞核内DNA 结合导致下游炎症相关基因的转录［28］。有研究［29］表明，IFN-γ 可通过糖原合酶激酶3 依赖机制抑制细胞因子信号转导抑制因子3（SOCS3），降低抗炎因子IL-10 的分泌。另外，IL-4 诱导的M2表型巨噬细胞活化主要与STAT6 有关，STAT6 可调控过氧化物酶增殖物激活受体（PPARs）等抗炎基因的转录［30］，PPARs 参与机体多种生理反应过程，包括脂质代谢、细胞增殖、分化及凋亡等的过程。PPAR-γ 是其中的一种亚型，在肺疾病中发挥重要作用，如ALI［31］、肺缺血-再灌注损伤［32］等。

3.1.3 IRF IRF 家族的SDTFs 在巨噬细胞激活程序中起着重要作用。其中，IRF1、IRF5 和IRF8 促进促炎巨噬细胞的激活，而IRF3 和IRF4 诱导抗炎巨噬细胞的激活［24］。WANG 等［33］研究发现，IRF5是促炎M1 表型巨噬细胞极化的重要转录因子，过表达miR-124 可抑制IRF5 核易位，从而降低M1 表型肺泡巨噬细胞极化。SUN 等［34］通过腹腔注射雨蛙肽诱导急性胰腺炎大鼠模型，并用IRF5 siRNA或IL-4 处理，从支气管肺泡灌洗液（BALF）中分离出肺巨噬细胞，结果发现经处理后的肺巨噬细胞由M1 表型向M2 表型逆转。

3.1.4 JNK c-Jun 氨基末端激酶（JNK）信号通路在炎症调节中也起重要作用，c-Myc 是JNK 下游典型的转录因子［35］。单核细胞趋化蛋白诱导蛋白1（MCPIP1）是一种炎症相关的核糖核酸酶，在LPS、IL-1β 或单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等炎性因子刺激作用下激活，可催化促炎细胞因子的降解［36］。ZHANG 等［35］研究表明，MCPIP1 通过抑制JNK/c-Myc 信号通路调控巨噬细胞向M2 表型极化，在脓毒症诱导的ALI 中发挥保护作用。

3.2 参与ncRNA 信号转导的转录因子 SOCS1是JAK/STAT 信号通路的负向调控因子。研究表明，SOCS1 是miR-155 的已知靶点，通过降低p65的稳定性可抑制NF-κB 的活性。在过表达miR-155 的巨噬细胞中，通过LPS 刺激后SOCS1 蛋白表达含量降低，巨噬细胞中NF-κB p65 蛋白表达量及促炎因子TNF-α 和IL-6 水平明显升高，而过表达SOCS1 可逆转miR-155 对巨噬细胞的促炎作用［14］。另外，Kruppel 样因子4（Klf4）是一种保守的核转录因子，在调节巨噬细胞向抗炎细胞分化过程中起着重要作用，现已证实，Klf4 是miR-34a 的作用靶点。miR-34a 在ALI 小鼠模型中表达增强，抑制巨噬细胞中miR-34a，Klf4 表达含量升高，促进向M2表型极化，从而改善肺损伤［37］。此外，还有研究［38］表明，Pellino1（PELI1）能够通过调节IRF5 的泛素化以及IRF5 的核易位来促进M1 巨噬细胞极化。WANG 等［33］学者进一步研究发现，TGF-β1 通过上调DNA 甲基转移酶1 来抑制miR-124 表达，从而增加PELI1 的表达以及IRF5 的核易位，促进M1 型巨噬细胞的极化，加重ALI 小鼠的肺组织损伤。

3.3 参与三羧酸循环的转录因子 三羧酸循环功能障碍与M1 表型巨噬细胞极化有关，巨噬细胞向M1 表型极化消耗糖酵解过程产生的ATP［39］，导致α-酮戊二酸（α-KG）与琥珀酸比率降低。α-KG 具有抗炎作用，能够调控LPS 诱导的ALI 小鼠肺组织中巨噬细胞向M2 表型极化；在小鼠肺泡巨噬细胞（MH-S）中，α-KG 能够增加PPAR-γ 的核易位促进M2 表型巨噬细胞的极化［31］。在体外实验中，LIU等［31］研究发现，α-KG 能够抑制MH-S 中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTORC1）/p70 核糖体蛋白S6 激酶（p70S6K）信号通路，从而抑制M1 表型巨噬细胞的极化。

4 基于巨噬细胞可塑性的中药防治ALI 的研究

近年来，越来越多临床病例已证明中药在防治ALI 中具有良好的疗效，并通过体内外实验提供了中药复方及其活性成分基于调控巨噬细胞可塑性改善肺部炎症的生物学证据，见表1。

表1 中药调控巨噬细胞极化的作用机制Tab.1 Mechanism of Traditional Chinese medicine regulating macrophage polarization

4.1 中药复方 麻黄汤和大承气汤联合使用作为肺肠合治方剂用于治疗肺部疾病已广泛用于临床。王瑞哲等［40］通过动物实验认为肺肠合治法能够下调NF-κB 信号通路的激活，并抑制肺泡巨噬细胞M1 极化，促使M2 极化，对LPS 诱导的ALI 大鼠模型肺组织发挥保护作用。国家一级中草药新药认证产品体外培养牛黄复方制剂（ICCBco）主要由牛黄、独脚莲、虎鞭等成分组成，具有清热解毒、化瘀消肿、祛瘀、促进组织再生之功效。LI 等［41］研究认为，在血吸虫病导致的家兔肺部门脉高压病变模型中，ICCBco 能够抑制肺泡巨噬细胞活化，改善肺部微循环。舒风解毒胶囊（SJC）（虎杖、连翘、板蓝根、柴胡、黄耆、马鞭草、芦根、甘草组成）在感染性疾病中具有有效的放大抗炎信号的作用，在铜绿假单胞菌（PAK）感染的急性呼吸道感染的小鼠模型中，SJC 能显著抑制模型小鼠肺损伤以及腹腔内巨噬细胞炎性细胞因子的分泌［42］。

4.2 中药活性成分 脱氢木香内酯（DHL）是我国常用的传统中草药，从雪莲和鹅耳菊中提取。DHL 在革兰阳性细菌诱导的炎症中具有强大的抗炎作用，WU 等［43］采用脂磷壁酸（LTA）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）进行体内外实验，结果表明DHL 能够促使巨噬细胞由M1 表型向M2 表型极化并减弱MRSA 诱导的ALI 小鼠肺部损伤。青萼草是一种治疗炎症的中药，从青萼草中可分离青萼龙葵糖蛋白（XPS），再从XPS 中纯化得到两种均质糖蛋白XPS5-1 和XPS10-1。REN 等［44］学者初步研究认为只有XPS 和XPS5-1 在体外具有很好的抗炎活性，通过LPS 刺激小鼠巨噬细胞ANA-1，采用ELISA、流式细胞术、Western blot 法等技术检测巨噬细胞的极化情况，结果表明，XPS 和XPS5-1 下调LPS 诱导的促炎介质的分泌，上调IL-10 分泌，并促进ANA-1 由M1 型向M2 型极化。黄芩苷是从传统中药黄芩中提取出的黄酮类化合物，具有良好的抗炎作用。杨冰等［45］学者采用LPS 处理人巨噬细胞U937 模拟体内ALI 的炎症环境，结果发现黄芩苷能够抑制U937 向M1 型巨噬细胞极化，并可降低由LPS 诱导的HMGB-1 蛋白的表达。中药姜黄素可促进幼稚CD4+T 细胞向CD4+CD25+Foxp3+Tregs 分化，减轻ALI 炎症反应，研究者还发现姜黄素还可促进巨噬细胞由M1 型向M2 型极化，可能是Tregs 分化产生的IL-10 介导的［46］。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是绿茶的主要成分，具有抗炎、抗氧化等的作用，研究表明，EGCG 可调节巨噬细胞向M2 型极化，降低LPS 诱导的肺部炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6 的表达，对小鼠肺组织起到保护作用［47］。另外，3，4-二羟基苯乙醇苷（DAG）具有抗炎、抗氧化等的活性，是在著名中药大血藤中提取的重要活性成分之一。经盲肠结扎和穿孔（CLP）诱导的ALI 小鼠模型中，流式结果显示，CLP 组小鼠脾脏及BALF 中M1 型巨噬细胞百分比明显高于假手术组，而经DAG 治疗后可显著降低M1 型巨噬细胞百分比，而M2 型巨噬细胞百分比未发生明显变化［48］。

5 结语与展望

表观遗传修饰和转录因子对不同表型巨噬细胞的调控在ALI 的发病机制中具有重要作用，是未来防治ALI 的潜在靶点。巨噬细胞参与了ALI/ARDS 的整个发病机制过程，通过微环境刺激不同的转录因子来调控巨噬细胞表型的改变，如细胞因子、ncRNA 等。在ALI 的防治方法中，虽然抗生素层出不穷，呼吸支持疗法也可有效改善ALI 引起的各种并发症状，但由于其存在创伤性、抗药性、药物毒副作用大且费用昂贵等问题，因此寻求一种更加安全高效的抗炎治疗方法显得尤为重要。鉴于巨噬细胞可塑性在ALI 发病机制中的关键作用以及中药在治疗肺炎、肾炎等炎症疾病中的作用，中药有望成为防治ALI 的潜在药物。但目前在ALI 模型中，应用中药调控巨噬细胞可塑性的分子机制的研究仍然较少，中药是否能够调控巨噬细胞可塑性成为防治ALI 的有效靶点还需要进一步研究，从而能够更加深入了解ALI 的发病机制，为临床防治ALI 提供新的理论依据。