网络药理学联合分子对接研究藏药六味木香丸治疗胃癌的分子作用机制＊

仁青东主，冯学梅，洛桑东智，华青措，英 措，刘军莉，桑杰卓玛，格日多杰，索南才旦多杰，三智加

（1.青海大学藏医学院 西宁 810001；2.青海省藏医院 西宁 8100071；3.青海大学医学院 西宁 810001）

六味木香丸藏医称“日达州巴”，最早收载于《四部医典》，由木香、豆蔻、余甘子、荜茇、巴夏嘎、石榴子等六味藏药材组成，主治“培根木布”病为主[1]。文献研究表明[2]，木香为菊科植物木香的根，主治胃肠鼓胀、息肉等功效。豆蔻为姜科植物白豆蔻的果实，主治脾胃不和、脘腹胀满等症。余甘子为大戟科植物余甘子的果实，主治消化不良、腹胀等症。荜茇为胡椒科植物荜茇果穗，主治脘腹冷痛、呕吐等症。塞北紫堇称“巴夏嘎”，主治赤巴热、刺痛、血热病等。石榴子为石榴科植物石榴的种子，主治食欲不振，胃寒痛，消化不良等症。现代研究表明，续艳丽等[3]通过六味木香丸的有效成分分析，发现该方剂对胃溃疡的炎症具有抑制作用。鲁建美等[4]发现，六味木香丸对胃部炎症起到抗炎、镇痛的作用。李海峰等[5]通过72 名肿瘤化疗患者的临床观察，发现该方剂对化疗药物的不良反应如恶心、呕吐等具有缓解作用。徐僮等[6]对藏药六味木香丸的有效成分进行分析，其君药木香所含木香烃内酯、去氢木香内酯为主要成分，具有抗炎、肿瘤作用。总之，藏医六味木香丸的总体功效围绕胃病及寒热混合证为主，其成分也表明对治疗胃癌具有潜在的挖掘价值。

胃癌是我国发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一。其发生发展过程一般经历慢性浅表性胃炎，慢性萎缩性胃炎，肠上皮化生，异型增生等几个阶段后，最终演化成胃癌[7-8]，各个阶段涉及不同的信号通路或者相同的信号通路。由于胃癌发生早起患者并不能发行明显或者特殊症状，这种发病的潜伏性导致很多患者发现时已经处于胃癌中晚期，因此，必须通过手术、化疗和急性靶向药物来达到抑制的目的，但复发转移率仍然很高，且手术创伤性极大，化疗和药物引起的副作用也很大。已有研究表明，民族医药因独特的复杂配方在预防和治疗胃癌方面显示出了独特的疗效，可以有效的避免上述几种治疗方式的缺点。

为了发现防止胃癌的藏药良方，课题组利用中医传承辅助平台软件（V2.0）数据分析平台，对慢性萎缩性胃炎及癌前病变的115 名患者所使用的690 首方剂进行分析，得出六味木香丸治疗萎缩性胃炎、胃溃疡、胃癌前病变的疗效显著，其胃镜、病理活检、症状的有效率分别达86%、86.6%、97.1%[9-12]。通过用药物频次、关联规则、核心组合、新方分析，得出六味木香丸是治疗该类疾病的核心组方[14]。基于前期靶点预测研究，发现该方剂主要通过ABL1、F2、ESR1、CYP2C9 等关键靶蛋白，调控androgenand estrogen metabolism、cytochrome P450、ErbB 等通路，参与细胞增殖、氧化反应、内分泌代谢、DNA 转录等过程，从多靶点、多通路协同作用，可能遏制慢性萎缩性胃炎的进一步恶化[13]。但六味木香丸如何有效防止胃癌的作用机制至今还不完全清楚。基于上述背景，本研究联合利用网络药理学和分子对接的方法，探索六味木香丸作用于胃癌的信号通路、代谢通路及潜在的疾病标志物等作用机制，预测六味木香丸抗胃癌的可能机制。

1 材料与方法

1.1 藏药化学成分及作用靶点信息获取及收集

六味木香丸组成药物中的木香、余甘子、豆蔻、荜茇、石榴子等五种药材的化学成分及作用靶点信息获取及收集从中药系统药理学技术平台（TCMSP，http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），筛选条件设置为口服生物利用度（OB）＞30%且类药性（DL）＞0.18。巴夏嘎（塞北紫堇）的化学成分在TCMSP 平台未能检索到，所以从文献查阅整理[14-18]，然后将成分在TCMSP 平台进行检索，满足OB 和DL 筛选条件的作为有效成分。此外，在TCMSP 平台上检索不到，但是文献报道和肿瘤相关的成分也作为有效成分进行后续分析。所有药物的化学成分的靶点从首先从TCMSP 中查找，然后查阅文献进一步补全。

1.2 疾病胃癌靶点选取

运 用 DrugBank、 GeneCards、 OMIM、 TTD、PharmGkb五大疾病数据库，输入与“胃癌”关键词获取胃癌疾病靶点，后经合并去除重复项获取得到胃癌疾病最终靶点。

1.3 胃癌疾病靶点与药物靶点映射

使用R 语言中的“Venn”包构建药物活性成分相关的靶点和疾病靶点的维恩图（venn）获得六味木香丸活性成分的潜在抗胃癌作用靶点。

1.4 药物-共活性成分-关键靶点网络的构建

通过上述整理获得“药物-成分”、“成分-疾病靶点”文件后，采用Cytoscape 软件（Version 3.8.0）构建“药物-活性成分-靶点”关系网络。

1.5 关键靶点蛋白相关作用网络的构建

首先预测上述获得的关键蛋白之间的关系，在STRING 数据库平台（https://string-db.org/Version10.5）上完成预测。并将预测的结果以TSV 格式导出。采用Cytoscape软件（Version3.8.0）构建“蛋白-蛋白”关系网络。并用插件CytoNCA获得核心蛋白网络。

1.6 通路注释与富集分析

使用R 语言中的“colorspace”“stringi”“ggplot2”和Bioconductor 包“DOSE”“clusterProfiler”“enrichplot”“pathview”完成GO和KEGG富集分析。

1.7 关键化合物和核心蛋白分子对接

将潜在靶点蛋白名称输入PDB（http://www.rcsb.org/pdb/）数据库中，找到相应蛋白的PDBID，保存为pdb 格式，从TCMSP 数据库查找靶蛋白对应的化合物成分，下载保存为mol2 格式，在PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取核心活性化合物2D 结构的sdf 格式文件。使用Pymol 软件对原PDB文件进行去除水和原配体处理，Autodock Tolls 软件为靶蛋白受体分子加极性氢，通过Autodock Vina 和Python脚本实现分子对接。分子对接过程中其结合能越低代表受体与配体的亲和力越好，本研究选取结合能≤-5.0 kJ·mol-1的作为化合物与靶点有效结合的筛选依据。

1.8 实验验证

1.8.1 准备供试药物

六味木香丸购自青海省藏院,制剂批次号：20210904。200 g 六味木香丸在1 L 85%的乙醇中超声提取3 次，将提取液进行浓缩，得到约50 mL 浓缩液，按照药物和培养液1:1 的比例配置六味木香丸提取供给母液，然后按照每100μL 培养液里面添加1.8、3.6、5.4、7.2 μL 六 味 木 香 丸 母 液，分 别 命 名 为LWMXW1、LWMXW2、LWMXW3、LWMXW4，不添加药物的为CK对照组。

1.8.2 细胞实验过程

人胃细胞系SGC-7901（产品编号C6795）购自碧云天。细胞在RPMI1640（批号C11875500BT，Gibco公司）基础培养液并含10%胎牛血清（批号42F7180K，Gibco 公司）中贴壁培养，培养条件为95% 空气+5%CO2，温度为37°C。当细胞密度生长到约85%左右时用重组胰酶细胞消化液（产品编号C0209）进行消化，铺96 孔板（8×103个/孔）的细胞用于检测细胞增殖和活性氧积累，铺100 mm 细胞培养皿（8×105个/皿）的细胞用于分析蛋白表达。细胞处理分对照组（RPMI1640）和不同浓度六味木香丸组（）。细胞经药物处理24 h 和48 h 后，将96 孔板中的处理液洗掉，用PBS 清洗两次后，每孔添加配置好的CCK-8 试剂（C0037）100 μL，培养箱中继续培养30 min 后，用酶标仪（SuPerMax 3000AL）测定各孔的450 nm 的吸光值，以空白对照组为参照，计算细胞相对活力。100 mm细胞培养皿中的细胞处理完后，先用PBS 清洗两次后，用胰酶进行消化，随后按照RIPA 裂解液(强)试剂盒（产品编号：P0013B）说明书提取蛋白，用BCA 蛋白测定试剂盒（产品编号：P0012S）测定蛋白浓度，用15%的 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）凝胶分离20 μg/孔的蛋白，随后转到polyvinylidene fluoride（PVDF）膜上，用5%脱脂奶粉室温下在脱色摇床上封闭1 h。然后加入兔抗STAT3 多克隆抗体（1:500，Order NO.:D320083），4℃下孵育过夜，用Tris Buffered saline Tween（TBST）在室温下脱色摇床上洗5 次，每次5 min，随后添加山羊抗小鼠IgG（1:5000）二抗，在室温下孵育1 h，并用TBST 在室温下脱色摇床上洗5 次，每次5 min。将极超敏ECL 化学发光试剂（产品编号：P0018FS）滴加至PVDF膜上，在暗处进行曝光、显影和定影。

2 结果

2.1 活性化合物的收集

通过查阅文献和TCMSP 数据库共获得六味木香丸有效活性成分42 个，其中槲皮素（quercetin）和木犀草素（luteolin）在余甘子、石榴子和豆蔻中都含有，此外，(+)-儿茶素（(+)-Catechin）、β - 谷 甾 醇（β -sitosterol）、鞣 花 酸（ellagic acid）、山奈酚（kaempferol）在石榴子和余甘子中都存在。而且我们发现不同的化合物可以作用于同一个靶点，PTGS1 是化合物tetrahydrocoptisine、quercetin、Pisatin、Pinocembrin、luteolin、 kaempferol、 Jaranol、 Cavidine、 Benzo[a]carbazole、7-O-Methyleriodictyol、5- [(2R, 3R) -7-methoxy-3-methyl-5- [(E) -prop-1-enyl] -2, 3-dihydrobenzofuran-2-yl]-1,3-benzodioxole、1,2,5,6-tetrahydrotanshinone、(2R) -7-hydroxy-5-methoxy-2-phenylchroman-4-one、(+)-catechin、tetrahydrocoptisine

的共同靶点（表1）。

表1 六味木香丸潜在活性成分和对应靶点信息

续表

2.2 活性化合物靶点和疾病靶点

胃癌的8953 个靶点与六味木香丸的301 个靶点利用R 语言进行匹配映射，并绘制维恩图（venn）获得271 个共同靶点，进一步确定了六味木香丸与胃癌的靶向作用关系（图1）。

图1 六味木香丸活性成分靶点和胃癌疾病靶点维恩图

2.3 药物-成分-靶点网络分析

将六味木香丸的42 活性成分与271 个潜在作用靶点导入Cytoscape 中，绘制药物-成分-靶点网络图（图2）。度值表示预测出该成分与作用靶点的关联个数，成分度值越大说明该成分越重要，此外发现一个成分存在于多个药物中，一种成分可与多个靶点作用，多种成分又可共同作用于同一个靶点，体现了藏药复方多成分、多靶点和协调递增效应的综合治疗特色。

图2 “药物-化合物-靶点”网络图

2.4 PPI网络图构建

在STRING 数据库中导入271 个潜在靶点，得到PPI 网络关系信息，发现243 个具有节点连接，删除那些没有节点连接的蛋白，保存网络，并导入Cytoscape对蛋白网络进行可视化分析，构建PPI 网络图（图3）。其中degree＞24（中位数）的有MAPK1、MAPK3、JUN、STAT3、AKT1、TP53、RELA、MAPK8、FOS、MAPK14 等22 个靶点。借助Cytoscape 软件的cytoNCA 插件对潜在治疗靶点进行拓扑属性分析获得核心富集模块主要涉及MAPK3、MAPK1、AKT1、JUN、TP53等。

图3 六味木香丸对抗胃癌靶点蛋白相互作用网络图（A：第一次筛选，B：第二次筛选）和关键基因相互作用网络图（C）

2.5 富集分析

利用R 语言相关富集分析包对靶点进行GO 富集分析和KEGG 通路分析，结果见图4，GO 分析结果显示六味木香丸的活性成分左右的相关蛋白基因主要富集到生物学过程中的氧化胁迫应激、药物反应应激和营养水平应激，分子功能DNA 结合转录激活和丝氨酸/苏氨酸激酶活性以及细胞组分中膜相关功能。KEGG生物学过程主要涉及：PI3K-Akt，MAPK，IL-17，TNF，HIF-1等信号通路（图4）。

图4 六味木香丸治疗胃癌的KEGG功能柱状图

2.6 活性化合物与核心靶点蛋白受体的分子对接结果

首先查找获得PPI网络图构建过程中筛选得到的4 个核心靶蛋白（MAPK3、MAPK1、JUN、STAT3）后，利用AutoDock Vina 软件和Python 脚本进行核心靶蛋白和对应化合物的分子对接，根据活性化合物与靶点蛋白受体间的结合活性度越高，则两者结合能月底的原则，本研究发现5 个活性化合物与4 个核心蛋白受体对接结果均低于-5.0 kJ·mol-1，其中Beta-sitosterol 与JUN 的结合能是-26.42 kJ·mol-1，是结合能最大的，其它结合能均低于30 kJ·mol-1，其中Quercetin 与JUN 的结合能32.58 kJ·mol-1，Luteolin 与MAPK1 结合能32.37 kJ·mol-1，(- ) -epigallocatechin-3-gallate 与MAPK3、MAPK1、JUN、STAT3 的结合能分别为35.80 kJ·mol-1、33.75 kJ·mol-1、32.94 kJ·mol-1、37.52 kJ·mol-1（表2）。这些结果说明六味木香丸活性化合物和胃癌核心靶点之间具有很好的结合能力。具体的对接结果见图5-图6，从对接图我们发现，Quercetin、Luteolin 和(-)-epigallocatechin-3-gallate 与MAPK1 靶蛋白的结合位点完全相同，其坐标是center_x =-7.922，center_y = -13.532，center_z = 20.697。 Quercetin、Luteolin、Kaempferol、Beta-sitosterol 和(-)-epigallocatechin-3-gallate 与JUN 靶蛋白的结合位点完全相同，其坐标是center_x =10.201，center_y = 0.493，center_z =19.492。(-)-epigallocatechin-3-gallate 与STAT3 靶 蛋 白的 结 合位 点 坐 标是center_x = -43.83，center_y = -43.908，center_z =8.422。 (- ) -epigallocatechin-3-gallate 与STAT3 靶蛋白的结合位点坐标是center_x = 15.01，center_y=-7.833，center_z=24.602（图6）。

图5 活性化合物与核心靶蛋白分子对接图

图6 (-)-epigallocatechin-3-gallate 与MAPK3(A)、MAPK1(B)、JUN(C)和STAT3(D)分子对接图

表2 化合物与核心靶点结合能

2.7 六味木香丸对胃癌细胞增殖和STAT3 蛋白表达的影响

本实验利用CCK-8 法检测不同浓度的六味木香丸处理SGC-7901 胃癌细胞48 h 或72 h 后细胞增殖（图7）。与空白对照组相比，六味木香丸能不同程度地抑制人胃癌SGC-7901 细胞的增殖，并呈时间和剂量依赖性，其中以1 μg·mL-1处理72 h 抑制最明显（P＜0.001）。利用蛋白质印迹法进一步检测六味木香丸对STAT3 蛋白表达的影响（图8），结果表明与对照相比，六味木香丸显著的抑制了STAT3 蛋白的表达，表明STAT3通路可能参与六味木香丸抑制胃癌过程。

图7 CCK-8法检测六味木香丸不同浓度和作用时间对SGC-7901细胞增殖能力的影响

图8 六味木香丸处理SGC-7901细胞48 h对STAT3蛋白表达水平的影响

3 讨论

藏药方剂具有所含成分多、靶点多、作用途径多的特点，而网络药理学融合了系统生物学和传统医药用药规律原创思路，从“药物-成分-靶点-疾病”间相互作用的整体性和系统性出发，可以全面系统地预测藏药在治疗疾病中发挥作用的主要成分和发挥作用的具体靶点，成为目前研究民族药物作用机制的一利器[19]。分子对接通过对靶标蛋白和小分子亲和能力的计算，预测蛋白与配体亲和能力和结合模式的强有力的工具[20]，可为进一步研究其作用机制提供理论依据。本研究通过网络药理学和分子对接的方法，筛选了藏药六味木香丸治疗胃癌的潜在活性成分和靶点，对六味木香丸的主要化学成分及其治疗胃癌的作用机制进行较全面系统地分析，为深入验证其作用机制提供依据，进一步为新药研发提供新的途径和策略。

根据藏医学“症-证-病”诊断模式[21]，胃癌可分型为热型和寒型两种，是由“三胃火”功能严重失调导致，并且具有胃部形成坚硬块状病变的表征。六味木香丸在临床上作为治疗胃癌的典型药物之一，其组方中凉、热性药物兼并（如木香、巴夏嘎、余甘子为凉性药物，石榴子、豆蔻、荜茇为热性药物），故对各类胃癌的早期防止具有潜在作用价值。课题组的前期研究也发现，六味木香丸是治疗胃病的核心组方，通过ABL1、F2、ESR1、CYP2C9 等 关 键 靶 蛋 白，调 控androgen and estrogen metabolism、cytochrome P450、ErbB 等通路，参与细胞增殖、氧化反应等过程，从多靶点、多通路协同作用，具有遏制慢性萎缩性胃炎发展为癌变的作用[13]。另外，现代研究表明，木香丸作为君药，含有萜类、生物碱、蒽醌和黄酮等，其中萜类为其主要有效成分，具有抗肿瘤、免疫调节作用[6]；白豆蔻中萜醇类和倍半萜烯类成分含量最高，发现豆蔻的提取物可以有效的抑制胃癌的增殖[22]；余甘子以酚类化合物为主，所含的没食子酸、槲皮素、鞣花酸的抗氧化性较强，对体液免疫的调节有积极影响。另外，余甘子还富含维生素C 和多酚类物质，临床试验发现它们有助于预防亚硝酸盐摄入引发的癌[23]。荜茇主要含胡椒碱、四氢胡椒碱等生物碱，还有天门冬氨酸、丝氨酸等多种氨基酸，具有抗胃溃疡活性。巴夏嘎也称鸭嘴花，含有鸭嘴花碱，在体外对人肺癌细胞等几种癌细胞具有明显的抑制作用，故通过细胞增殖通路发挥抗癌作用；石榴子含有甾类、鞣质、磷脂、三酰甘油等化学成分，其中的石榴酸等可以抑制结肠癌等癌症的发生[24]，这些实验结果为六味木香丸治疗胃癌提供了重要的科学依据。

本研究最终预测得到六味木香丸对治疗胃癌的42 个活性化合物中，槲皮素（quercetin）和木犀草素（luteolin）在余甘子、石榴子和豆蔻中都含有，(+)-儿茶素（(+)-Catechin）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、鞣花酸（ellagic acid）、山奈酚（kaempferol）在石榴子和余甘子中都有。通过HPLC 法能够检测到六味木香丸中鞣花酸、胡椒碱、木香烃内酯、去氢木香内酯四种成分。胡椒碱仅仅存在于荜拨中，而鞣花酸存在于石榴子和余甘子中。木香烃内酯和去氢木香内酯是木香的代表性成分。通过TCMSP 数据库我们发现鞣花酸和胡椒碱的OB值分别为43.06%和42.52%，DL值分别为0.43和0.23；但木香烃内酯的OB 和DL 值分别为29.07%和0.11，不满足活性成分的筛选条件。去氢木香内酯在TCMSP 数据库中未检索到。已经有多个研究报道木香烃内酯和去氢木香内酯能够通过不同的靶点抑制多种癌细胞的增值，这些结果说明虽然有些活性成分不能满足口服度等理论筛选指标，但其能表现出很强的特定药理活性，进一步指示我们今后在收集活性成分中应该从理论筛选和实际实验报道综合考虑。此外，我们也发现同一个靶点可以被多个化合物作用，比如，PTGS1 是化合物tetrahydrocoptisine 、quercetin、Pisatin、Pinocembrin、luteolin、kaempferol、Jaranol、Cavidine、Benzo[a]carbazole、7-O-Methyleriodictyol等化合物的共同靶点。这充分体现了藏医在复方配伍中的独特之处。靶点MAPK、JUN、STAT3 在网络中处于核心位置，是六味木香丸对治疗胃癌的重要潜在靶点。其中MAPK 是细胞内重要的信号传递者，可通过磷酸化核转录因子、相关酶类等参与细胞增殖、分化、凋亡、炎症反应、应激反应及免疫防御等多种生物过程；与正常患者相比，肿瘤患者MAPK 家族蛋白表达明显发生改变，表明MAPK 确实参与了肿瘤的发生与发展。作为第一个被发现的致癌转录因子，JUN 蛋白是由原癌基因（c-JUN）编码产生的蛋白，与病毒癌蛋白v-jun 同源。c-JUN 对紫外线诱导的细胞凋亡有保护作用，并与NF-κB 协同作用抑制了TNF-α 诱导的细胞凋亡。信号转导和转录激活因子3（STAT3）是STAT 家族中的其中一个成员，也是JAK-STAT信号通路的转录因子。研究表明，当外界因子作用于STAT3时，STAT3 会被磷酸化，磷酸化的STAT3 是STAT3 的活化形式，会进入到细胞核中，进一步调控靶基因的转录和表达。上它的靶蛋白包括基质金属蛋白酶类2 等。STAT3 在胃癌组织中的表达比正常组织明显升高，有研究证明STAT3 在胃癌的发生和进展过程中起着显著的正性调节作用。通过细胞实验发现，六味木香丸显著的抑制了胃癌细胞的增殖和STAT3 蛋白的表达，这些结果进一步支持了STAT3 在胃癌中的正调节作用，同时也暗示STAT3 途径可能是六味木香丸抑制胃癌细胞增殖过程中的重要靶标蛋白之一，这也体现了网络药理学预测到结果的可靠性。综上所述，六味木香丸可能通过胃癌中这些关键蛋白进一步影响胃癌的发生和发展。

综上所述，胃癌的形成与发展是一个由多基因调控、多因素参与、多信号通路交叉作用的复杂过程，其治疗至今仍然是一个世界性难题。藏药复方以其“多成分、多靶点、多途径”的特点在胃癌防治方面展现出独特优势。本研究运用网络药理学，分析六味木香丸治疗胃癌的有效活性成分、关键靶点，为下一步从药理学角度阐明六味木香丸抗胃癌的具体作用机制提供了目标和思路。