琥珀调控颈总动脉结扎脑缺血大鼠海马区神经元凋亡改善大鼠学习与记忆能力的效用部位与作用机制研究＊

魏翀琦，曹 程，刘梦秋，曲苏晨，楼倩颖，段金廒，尚尔鑫，朱 悦

（南京中医药大学药学院/江苏省方剂研究重点实验室/江苏省方剂高技术研究重点实验室/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心/江苏省中药资源产业化过程协同创新中心 南京 210023）

琥珀是距今3 亿年前的中生代白垩纪至距今0.2亿年前的新生代第三纪的松柏科和豆科植物的树脂经过复杂的地质作用在地壳表层所形成的有机矿物[1-2]，是重镇安神的代表性中药材，其入药的最早记载见于南朝宋陶弘景所著《名医别录》。明李时珍《本草纲目》描述琥珀功效为“安五脏、定魂魄、消淤血、通五淋、壮心明目、止痛安神、破血生肌”[3]。《中华本草》将琥珀功效总结为“镇惊安神；散瘀止血；利水通淋；去翳明目”[4]。现代琥珀常用于治疗惊风癫痫、心神不宁、痴呆、失眠多梦、月经停闭、小便涩痛、瘀血等病。但是长久以来，琥珀的现代研究主要集中于宝石学领域，侧重于理化性质研究与真伪鉴别探讨居多，而对其镇惊安神与活血化瘀的作用机制等报道偏少。这种现象直接导致了琥珀在被《中华人民共和国药典》1963 版与1977 版收载后，便绝迹于之后历版中国药典。虽然各省市的中药材地方标准仍有收载，仅有简单的外观描述，也无质量控制方法，不仅严重制约了琥珀的现代中医临床应用，还为现今药典中含有琥珀药材成方制剂的质控指标的进一步提升与临床安全用药埋下了隐患。

血管性痴呆（Vascular dementia, VD）是以脑血管疾病导致脑神经损伤为基础的认知功能损害疾患。患者常于脑血管疾病后出现记忆、认知和执行功能下降等临床表现，是继阿尔茨海默病后发病率位列第二的痴呆症[5-6]。患者脑部缺血时，脑内缺氧缺血会导致神经元凋亡，进而影响认知功能。琥珀是中医临床用治健忘的常用中药材，清代沈金鳌内科名著《杂病源流犀烛》将其用于治疗“痰迷心窍，言语如痴而多忘”[7]，而其“活血散瘀”的功效应对VD 更可谓合拍对症。因此我们构建颈总动脉结扎脑缺血大鼠模型与糖氧剥夺神经元细胞模型，研究琥珀调控神经元细胞凋亡抗血管性痴呆的效用部位和作用机制，阐释琥珀药材“安神”与“散瘀”的传统功效，为其临床应用提供更多的现代科学依据。

本研究整体框架流程如图1所示。

图1 研究流程图

1 材料

1.1 动物

SD 大鼠（雄性，280-300 g），购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号SCXK（沪）2017-0005。动物常规饲养于南京中医药大学动物实验中心，SPF 级环境，12 h光照，温度为22-25℃，湿度为40%-70%。

1.2 药物

琥珀药材饮片购自陕西兴盛德药业有限责任公司（批号：20180101），药材产地为广西壮族自治区，经南京中医药大学段金廒教授鉴定为合格药材。

1.3 试剂

TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（A112-01）购自Vazyme Biotech 公司。实验所用抗体MAP2 Rabbit mAb（4542S）、Caspase 3 Rabbit mAb（9662S），Cleaved-Caspase 3 Rabbit mAb（9664S），Caspase 9 Rabbit mAb（9508S），Cleaved-Caspase 9 Rabbit mAb（7237S），Anti-rabbit IgG，Anti-mouse IgG，HRP-linked Antibody（BA1054,BA1050）购自Boster Biological Technology 公司。抗体Bcl-2 Mouse mAb（sc-7382）、Bax Mouse mAb（sc-7480）购自Santa Cruz Biotechnology 公司。抗体β-actin Rabbit mAb（bs0061R）购自北京博奥森生物技术有限公司。ECL 化学发光液购自上海天能公司。DMEM 培养基（4.5g·L-1D-Glucose，10-013-CVRC）购自Corning 公司。特级胎牛血清（04-001-1ACS）、胰酶（0.25%，03-046-5B）和青链霉素/制真菌素三抗（03-032-1B）购自Biological Industries 公司。PBS 缓冲液（MBL601A）购自南京迈博生物科技有限公司。细胞培养相关耗材均购自Corning 与BIOSHARP 公司。其余试剂如未特殊标明均购自Sigma-Aldrich公司。

1.4 仪器

实验动物行为测试与分析系统（上海吉量软件科技有限公司）；生物安全柜（Thermo Fisher Scientific 公司）；恒温细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific 公司）；凝胶成像系统仪（伯乐生命医学产品公司）；多功能酶标仪（Perkin-Elmer 公司）；微孔板恒温振荡器（Thermo Fisher Scientific 公司）；AXIO Vert.A1 荧光倒置显微镜（Zeiss公司）。

2 方法

2.1 琥珀系列溶剂提取部位的制备

将琥珀药材粉碎后，称取50g，并采用10倍量石油醚溶剂每次8h，回流提取2 次，过滤后合并2 次滤液。向滤渣中加入10倍量乙酸乙酯溶剂，操作同上。如上所述依次制备正丁醇与70%乙醇提取部位。将以上各提取液减压浓缩并将残余有机试剂挥发干净得到琥珀不同溶剂提取部位。使用前，按需复溶。按照图2样品制备流程图制备琥珀各溶剂提取部位。

图2 琥珀提取部位制备流程图

2.2 血管性痴呆模型建立

所有大鼠适应环境一周后，参考文献通过结扎大鼠颈总动脉建立VD模型[8]。随机选择8只大鼠作为假手术组动物，接受同样手术操作，而不结扎颈总动脉。手术后采用Morris 水迷宫测试判断模型是否建立成功。

2.3 动物给药

待动物恢复2 周后，将80 只造模成功大鼠随机分为10 组，具体分组与给药如表1 所示，琥珀系列溶剂提取物给药剂量均按照得率折算成相应生药量。灌胃给药周期为14天。

表1 动物实验给药剂量

2.4 行为学检测

采用Morris水迷宫对大鼠的学习与记忆能力进行测评。于宽120 cm的圆柱形水池中放置一高60 cm跳台。向水池中注入自来水并调整水温至25℃，水中放入墨汁，以动物不能看到跳台为宜。跳台放入第IV象限，大鼠从第II 象限面朝水缸壁入水，若大鼠在120 s规定时间内不能寻找到平台，则引导大鼠到平台，站立30 s。大鼠每日训练一次，每次按顺时针方向训练一个象限，连续训练4 天。于第5 天开始进行行为学测试：第一次测试时，保留水下跳台，将大鼠从第Ⅲ象限面朝缸壁放入水中，测试60 s，摄像机记录大鼠的潜伏期和上台前路程；第6天进行第二次测试，撤走水下跳台，大鼠从第Ⅳ象限面朝缸壁放入水中，自由游泳探索60 s，摄像机记录大鼠的跳台穿越次数和跳台所在象限停留时间。所有的行为数据通过ANY-maze软件进行分析。

2.5 TUNEL染色法检测海马区细胞凋亡

行为学检测结束后，解剖大鼠获得全脑组织固定于4%PFA 固定液中，脱水处理后进行石蜡包埋切片。脑组织切片再进行二甲苯脱蜡处理，乙醇梯度脱水，加入不含DNase 的20 μg·mL-1蛋白酶K，室温下孵育20 min。用50 μL TdT缓冲液处理切片，避光室温下孵育1 h，然后用DAPI试剂进行细胞核染色，再用荧光封片剂进行封片处理。在荧光倒置显微镜下摄片，并运用ZEN软件进行图象处理与分析。

2.6 细胞培养与体外模型建立

小鼠海马永生化细胞系（HT22）购自赛业生物科技有限公司。培养条件为37℃，5%CO2。培养基组成包括DMEM（高糖，4.5 mg·L-1），10%胎牛血清和1%青链霉素/制真菌素三抗（PSN）。细胞每48h 进行换液，待融合密度为70%-80%即可进行传代操作，传3代稳定后的细胞用于后续实验。根据文献[9-10]，将培养基更换为不含葡萄糖的DMEM，并将细胞在充满95% (v/v)N2和5%(v/v)CO2的小型厌氧室中培养以建立体外糖氧剥夺模型。

2.7 MTT法

细胞给药6 h 后，弃去原培养基并加入MTT 溶液（每孔终浓度为0.5 mg·mL-1），37℃培养箱中避光孵育。3 h 后弃去MTT 溶液并加入150 μL DMSO 溶液，37℃避光振荡器上孵育30 min。采用多功能酶标仪在570 nm下检测吸光度。

2.8 免疫蛋白印迹法

取解剖所得大鼠海马组织或细胞末次给药后，采用RIPA 蛋白裂解液提取细胞总蛋白，98℃高温加热15 min 使蛋白变性。按照免疫蛋白印迹法实验步骤，首先制备10%聚丙烯酰胺凝胶，上样5 μg 总蛋白后，90V 电泳2 h，300mA 转膜2 h，5%BSA 封闭2 h 后加入一 抗（MAP2 Rabbit mAb、Caspase 3 Rabbit mAb、Cleaved-Caspase 3 Rabbit mAb、Caspase 9 Rabbit mAb、Cleaved-Caspase 9 Rabbit mAb、Bcl-2 Mouse mAb、Bax Mouse mAb、β-actin Rabbit mAb），抗体比例为1:2000，4℃过夜孵育，取出后常温放置45 min，再加入二抗（Anti-rabbit IgG, Anti-mouse IgG， HRP-linked Antibody），比例为1:10000，置摇床上室温孵育1 h 后以ECL 试剂盒显色，采用凝胶成像系统（Bio-Rad）进行数据处理。

2.9 统计学分析与数据表示

采用SPSS 16.0软件进行统计与分析，组间比较先采用T-test，后采用One-way ANOVA，数据以P＜0.05表示有显著差异，以P＜0.01表示有极显著差异。

3 结果

3.1 琥珀系列溶剂提取部位改善颈总动脉结扎脑缺血大鼠学习与记忆能力的效用评价

大鼠给以琥珀各溶剂提取部位14天后，进行定位航行实验和空间探索实验。结果表明，与假手术组相比，模型组潜伏期和上台前路程显著增加（P＜0.01），跳台穿越次数和跳台所在象限停留时间显著降低（P＜0.01）；给药组与模型组相比，琥珀各提取部位均有下调模型动物潜伏期和上台前路程，并上调其跳台穿越次数和跳台所在象限停留时间的作用（P＜0.05）。其中乙酸乙酯提取部位与其他部位进行显著性检验，发现乙酸乙酯提取部位效用最强，显著降低模型动物潜伏期时间（P＜0.01），其高剂量组显著增加模型动物跳台穿越次数（P＜0.05），作用趋势与阳性药石杉碱甲相当（图3）。

3.2 琥珀乙酸乙酯提取部位对颈总动脉结扎脑缺血大鼠大鼠海马区细胞凋亡的影响

选取行为学测试中效应趋势最强的乙酸乙酯提取部位组动物，分离并获取受试动物全脑，利用TUNEL 染色技术标记凋亡细胞。实验结果表明，模型组与假手术组相比，凋亡细胞数量显著增加（凋亡细胞呈绿色荧光）。给以琥珀乙酸乙酯提取部位后，凋亡细胞显著减少，提示琥珀给药可以通过抑制细胞凋亡保护海马区细胞（图4）。

图4 琥珀乙酸乙酯提取部位对大鼠海马区细胞凋亡的影响（n=3）

3.3 琥珀乙酸乙酯提取部位对颈总动脉结扎脑缺血大鼠海马区神经元细胞标记物的影响

利用免疫蛋白印迹法检测海马中神经元细胞生物标记物MAP2 的表达。实验结果表明，模型动物海马区MAP2的表达水平较假手术组显著下调。与模型组相比，琥珀乙酸乙酯提取部位显著上调模型动物海马区的MAP2 的表达（P＜0.01），提示琥珀给药对颈总动脉结扎致血管性痴呆大鼠海马区神经元有保护作用（图5）。

图5 琥珀乙酸乙酯提取部位对大鼠海马区神经元细胞的影响（n=3）

3.4 琥珀乙酸乙酯提取部位对颈总动脉结扎脑缺血大鼠海马凋亡蛋白表达的影响

分离受试大鼠海马组织，采用免疫蛋白印迹法检测海马中凋亡相关蛋白Caspase 3、Cleaved-Caspase 3、Caspase 9、Cleaved-Caspase 9 和Bcl-2/Bax 的相对表达水平。实验结果表明，模型动物海马区Caspase 3、Cleaved-Caspase 3、Caspase 9 和Cleaved-Caspase 9 的表达水平较假手术组显著上调，而Bcl-2/Bax 较假手术组显著下调（P＜0.05）。与模型组相比，琥珀乙酸乙酯提取部位显著下调模型动物海马区中Caspase 3、Cleaved-Caspase 3、Caspase 9 和Cleaved-Caspase 9 的表达，同时上调了Bcl-2/Bax 的表达（P＜0.05）（图6）。上述实验结果提示琥珀乙酸乙酯提取部位给药可抑制颈总动脉结扎致脑缺血大鼠海马区细胞凋亡（图6）。

图6 琥珀乙酸乙酯提取部位对颈总动脉结扎脑缺血大鼠海马区凋亡蛋白表达的影响（n=3）

3.5 琥珀乙酸乙酯提取部位对OGD 损伤HT22 细胞的影响

为了进一步评价琥珀乙酸乙酯提取部位抗海马区神经元凋亡效用，采用小鼠海马神经元HT22 细胞株于无糖无氧条件下建立了OGD 损伤模型。在无氧环境下，采用无糖培养基与琥珀乙酸乙酯提取部位同时作用HT22 细胞6h。采用MTT 法检测模型的存活率。实验结果发现，与OGD 组相比，琥珀乙酸乙酯提取部位能提高HT22 细胞的存活率，对抗OGD 对于HT22细胞的损伤（P＜0.05），以琥珀乙酸乙酯提取部位高 浓 度（10 μg·mL-1）的 细 胞 保 护 作 用 趋 势 最 强（图7A）。

依据上述实验结果，我们进一步对HT22 细胞给以琥珀乙酸乙酯提取部位后细胞凋亡信号通路相关蛋白表达情况进行评价。实验结果显示，OGD 模型组细胞Caspase 3、Caspase 9 的表达水平较空白组显著上调，而Bcl-2/Bax 较空白组显著下调，提示OGD 损伤促进细胞凋亡表达。而琥珀乙酸乙酯提取部位显著逆转上述表达趋势，表现在下调细胞中Caspase 3 和Caspase 9 的表达，同时上调了Bcl-2/Bax 的表达（与OGD 组相比，P＜0.05）（图7B 和图7C）。上述实验结果提示琥珀乙酸乙酯提取部位可抑制糖氧剥夺导致的海马细胞凋亡。

图7 琥珀乙酸乙酯提取部位对OGD损伤HT22细胞的影响

4 讨论

为了阐释琥珀“安神”与“散瘀”的传统功效与改善学习记忆能力抗血管性痴呆的功效物质基础，我们分别制备了琥珀的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇与70%乙醇提取部位，同时构建了常用于模拟VD 的大鼠颈总动脉结扎脑缺血动物模型，以评价提取部位作用趋势。研究发现，颈总动脉结扎脑缺血大鼠海马区发生了显著的细胞凋亡，表现为Caspase 3 和Caspase 9 及相关cleave 活化状态凋亡通路蛋白及表达上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2 表达下调[11-13]。同时发现海马区神经元生物标志物微管相关蛋白2（MAP2）表达的显著下调，提示海马区有神经元凋亡情况发生。琥珀的四个提取部位均可有效改善模型动物学习与记忆能力，其中以乙酸乙酯部位效用最优。该部位可以显著抑制大鼠海马区细胞凋亡，上调大鼠海马内微管相关蛋白2（MAP2）表达，同时下调Caspase 3 和Caspase 9 及相关cleave 活化状态凋亡蛋白的表达，上调Bcl-2/Bax 的表达。在OGD 损伤小鼠海马神经元体外细胞模型中也发现，琥珀乙酸乙酯提取部位给药能显著提高HT22 细胞的存活率并呈剂量相关性。与空白组相比，OGD 模型组细胞Caspase 3、Caspase 9 的表达水平显著上调，Bcl-2/Bax 显著下调，提示OGD 损伤后HT22 细胞中确有凋亡过程发生。而琥珀乙酸乙酯提取部位给药后通过下调细胞中Caspase 3 和Caspase 9的表达，上调Bcl-2/Bax 的表达，抑制凋亡继而发挥细胞保护效果。这些研究结果提示，琥珀乙酸乙酯提取部位可能是其发挥“安神”与“散瘀”传统功效与抗VD的功效物质基础。

目前VD 是发病率仅次于阿尔茨海默症位列第二的痴呆症。但是用于VD 治疗的多为阿尔茨海默症的治疗药物如多奈哌齐、加兰他敏和卡巴拉汀等乙酰胆碱酯酶抑制剂和谷氨酸NMDA 受体拮抗剂美金刚、以及钙拮抗剂尼莫地平与丁苯酞、脑活素等，缺乏专属性[14-16]。临床研究发现VD 患者脑部缺血缺氧时，中脑动脉供血脑区如皮质、海马和纹状体等部位会产生大量自由基、兴奋性氨基酸，导致细胞内钙超载，引起神经元凋亡进而导致神经元坏死是VD 重要的病理机制[17-19]。而本研究发现，琥珀的乙酸乙酯提取部位可以显著抑制缺血缺氧导致的海马区神经元凋亡，显著改善模型动物的学习与记忆能力。琥珀是具有重镇安神功效的代表性中药材，中医临床常将其用于治疗神志不安与血瘀证[20]，而其“安神”与“活血散瘀”的功效特点，更符合血管性痴呆的中医药治疗。因此，本研究对于琥珀“安神”与“散瘀”的传统功效的现代研究及对功效物质基础的探索，对于VD 的中医药治疗与相应的医药产品具有重要的意义。

以往针对琥珀“镇惊安神”功效作用机制的研究主要集中于癫痫的研究。琥珀对中枢神经有一定的抑制作用，且与戊巴比妥钠有协同作用[21]。本课题组前期研究亦发现，琥珀可明显延长戊四氮致急性癫痫模型模型小鼠的癫痫潜伏期，缩短癫痫持续时间，降低模型小鼠的癫痫等级，其中乙酸乙酯部位为效用最强的部位[22]。在我们本次的血管性痴呆动物模型上，该部位亦表现出最强的增强模型动物学习记忆能力的效用。有关琥珀镇惊安神效用成分研究中，琥珀酸的神经活性研究报道相对较多，其具有镇静与降低体温的作用，对惊厥幼鼠小脑浦肯野细胞的电生理功能具有明显保护作用[23]，可调节神经调质继而影响突触后兴奋性活动[24]。但是我们研究发现，不同产地琥珀中琥珀酸含量差异较大，在本实验中采用的琥珀药材经过前期质谱鉴定亦仅含有微量琥珀酸。此外，从日本久慈琥珀（Kuji Amber）中分离得到的kujiol A 和kujigamberol B 被证明是Ca2+信号转导抑制剂[25-26]。而Ca2+作为重要的第二信使，在癫痫等神经退行性疾病的病理生理过程中起着重要作用[27]。琥珀挥发油中的氧化石竹烯也具有良好的镇静作用[28]。从这些报道可以初步认为，琥珀镇惊安神的效用可能是其多成分协同作用的结果。

本研究结合血管性痴呆动物与细胞模型，首次对琥珀药材“安神”与“散瘀”的传统功效进行了综合阐释，并对其改善血管性痴呆的作用机制与功效物质基础进行了探讨。在今后的研究中，我们将进一步采用活性跟踪分离等手段，揭示琥珀乙酸乙酯提取部位中所含成分，进一步阐明物质基础，以期为这一宝贵矿物药材的临床应用提供更多的现代科学依据，为资源易于枯竭的化石类中药的可持续利用开发提供方法学借鉴，并助力于相关产品的现代开发与应用。