麋角丸改善Aβ1-42海马区注射小鼠学习与记忆能力的作用机制研究＊

孟雪儿，楼倩颖，曹 程，王青青，佘雨岩，白加德，丁玉华，段金廒，朱 悦＊＊，赵 明＊＊

（1.南京中医药大学药学院/江苏省方剂研究重点实验室/江苏省方剂高技术研究重点实验室/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心/江苏省中药资源产业化过程协同创新中心 南京 210029；2.北京麋鹿生态实验中心 北京 100076；3.江苏大丰麋鹿国家级自然保护区 大丰 224136）

阿尔茨海默症（Alzheimer 's disease, AD）是老龄化社会备受关注的神经退行性疾病，以认知功能的进行性下降和神经元的不可逆损失为重要特征[1]。随着全球老龄化人口急剧增加，中国的人口老龄化率和老年人口数量居世界第一。根据《2018 年世界老年痴呆症报告》显示，全球约有5000万人患有痴呆症，预计到2050 年，这一数字将增加两倍，达到1.52 亿人，而阿尔茨海默病(AD)占所有痴呆症病例的50-75%[2]。中国AD 的患病率较高，然而就诊率、诊断率和治疗率普遍较低，预计未来30年中国的AD患者数量将显著增加，给社会造成严重的经济负担。

AD 患者大脑最主要的病理学特征是β 淀粉样蛋白（Aβ）沉积形成老年斑和tau蛋白异常磷酸化为主要成分的神经纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）[3]。目前认为AD 的病理机制与氧化应激、炎症反应导致的神经元凋亡高度相关。氧化应激反应中的自由基可促进产生Aβ 聚集，小胶质细胞过度激活和大量释放的促炎细胞因子均会产生显著的神经元毒性，诱导神经元凋亡[4]。临床上治疗AD 的药物主要为胆碱酯酶抑制剂和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂，但此类药物会导致胃肠道反应等副作用，前者还禁用于心功能不全患者，从使其临床应用受到了一定的限制。

到目前为止，全球还没有药物可以有效的延缓AD的进展，而中医药对AD的防治有着丰富经验。AD在中医上属于“好忘”“痴呆”“呆病”等范畴，并认为髓海空虚，髓减脑消为痴呆的根本病机[5]。中药复方麋角丸出自唐代孙思邈《备急千金要方》[6]，由麋鹿角、秦艽、人参、甘草、肉苁蓉、槟榔、通草、菟丝子组成，是补肾名方，原书描述其具有“补心神、安脏腑、填骨髓”之功效。根据中医学“肾通髓海”的传统理论及其麋鹿角“补心神”的传统功效，本研究建立海马区注射Aβ1-42拟阿尔茨海默症小鼠模型，评价中药复方麋角丸对模型动物学习与记忆能力的影响及其神经保护作用机制，为其临床应用与二次开发提供更多的现代科学依据，并为AD 的防治提供更多的可能性。本研究的详细流程图如图1。

图1 研究流程图

1 材料

1.1 实验动物

健康SPF 级ICR 小鼠，雄性，体质量20-23 g，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，动物申请许可证号为：SCXK（沪）2018-0004。动物饲养于南京中医药大学实验动物中心SPF 环境中，常规饲养，温度22-25℃，湿度40%-70%。本实验获得NJUCM 动物实验伦理委员会的批准。

1.2 实验药物

麋鹿角Elaphurus davidianusMillne-Edwards 采集于江苏大丰湿地公园6 岁龄麋鹿，秦艽（Gentiana macrophyllaPall.，批号：201205）、人参（Panax ginsengC.A.Mey.，批号：190615）、甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.，批号：200128）、肉苁蓉（Cistanche deserticolaY.C.Ma.，批号：190808）、槟榔（Areca catechuL.，批号：210118）、木通（Akebia tri foliata（Thunb.）Koidz.，批号：201116）、酒菟丝子（Cuscuta chinensisLam.，批号：202022）采购于苏州市天灵中药饮片有限公司，经南京中医药大学鉴定教研室刘圣金教授鉴定为合格药材。

1.3 实验试剂

Aβ1-42（20JW09891）合成多肽购自上海诺优生物科技有限公司；石杉碱甲（H107336）购自北京伊诺凯科技有限公司；双色预染蛋白Marker 购自南京麦高德生物科技有限公司；10、12.5%凝胶试剂盒购自上海雅酶生物科技有限公司；RIPA 裂解液购自碧云天公司；BCA 试剂盒（P0009）购自南京何苗生物技术有限公司；小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA 试剂盒（JEB-12474-1）、小鼠白介素1β（IL-1β）ELISA 试剂盒（JEB-12787-1）、小鼠白介素6（IL-6）ELISA 试剂盒（JEB-12267-1）均购自南京金益柏生物技术有限公司；小鼠超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（A001-3-2）、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（A020-202）、丙二醛（MDA）试剂盒（A003-4-1）均购自南京建成生物公司研究所；通用型抗体稀释液，购自南京迅贝生物科技有限公司；ECL化学发光液，购自上海天能科技有限公司；Nrf2 Rabbit mAb（12721T）、Caspase-9 Mouse mAb（9508S），均购自CST 公司；HO-1 Rabbit antibody（10701-1-lg）、Caspase-3 Rabbit antibody（66470-2-lg）、β -actin Mouse antibody（66009-1-lg）均购自proteintech 公司；Bax（F2816）、Bcl-2（G2915）抗 体，购 自Santa Cruz Biotechnology 公司；二抗HRP-Linked Anti-Mouse IgG（BA1050），HRP-Linked Anti-Rabbit IgG（BA1054），购自BOSTER公司。

1.4 实验仪器

高速冷冻离心机（美国BECKMAN 公司）；旋转蒸发仪（瑞士BUCHI 公司）；动物行为测试系统（上海吉量软件公司）；全自动样品快速研磨仪（上海净业信发展有限公司）；多功能酶标仪（美国PE Enspire 公司）；凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；AXIOVert.A1荧光倒置显微镜（德国Zeiss公司）。

2 方法

2.1 麋角丸提取物的制备

取麋鹿角切割，捣碎，打粉，称取34 g 麋鹿角粉，加8 倍水提取8 h，回流提取三次，过滤，合并滤液。称取秦艽、人参、肉苁蓉、槟榔、木通、酒菟丝子各31.25 g，提取时间2 h，加8 倍80%醇回流提取2 h，提取两次，收集滤液，与麋鹿角水提液合并滤液，减压浓缩至麋角丸提取物浓缩液浓度为1 g·mL-1（按生药量折算）。

2.2 AD动物模型建立及给药

健康ICR 小鼠90 只，适应性饲养一周后随机分为6组，每组15只。分为空白组、假手术组、模型组、阳性药组、麋角丸低剂量组、麋角丸高剂量组。取小鼠称重，1%戊巴比妥钠腹腔注射小鼠（40 mg·kg-1），麻醉后剃除头顶局部毛发，进行海马区注射Aβ1-42拟AD 小鼠模型手术，手术的具体方法参考文献[7]。小鼠术后常规饲养，伤口基本愈合后进行灌胃给药，动物的分组和给药情况见表1。除上述分组给药外，另取健康ICR小鼠30 只，随机分为3 组，分别为空白组、麋角丸低剂量组、麋角丸高剂量组，适应环境后灌胃麋角丸低、高剂量10天后进行正常小鼠自发活动的评估。

表1 动物分组和给药剂量

2.3 行为学测试

2.3.1 Morris水迷宫实验

小鼠灌胃10 天后进行Morris 水迷宫实验（Morris water maze，MWM），评价小鼠空间学习和记忆能力。水迷宫具体方法参照课题组已发表的研究文章进行[8]。

2.3.2 旷场实验

小鼠灌胃10 天后进行旷场实验（open field test，OPT），评价麋角丸对正常小鼠自主活动的影响。旷场实验的敞箱装置为长宽40 cm，高25 cm 的塑料箱，箱的四周底部均为黑色。正式实验开始时将小鼠由边缘放入敞箱内，通过动物行为测试系统记录小鼠在旷场5 min 内的运动总路程和探索旷场中心停留的时间。每只小鼠测试完之后用75%乙醇擦拭敞箱，防止遗留的气味对下一只小鼠的影响，整个实验过程保持外部环境安静[9]。

2.4 海马区脑片尼氏体染色

小鼠行为学测试后解剖，断头，取出大脑，置于4%的多聚甲醛中固定。梯度乙醇脱水，二甲苯脱蜡，将固定的脑组织常规处理石蜡包埋，切片（厚度为5 μm），尼氏染色，光学显微镜下观察小鼠海马齿状回区神经元损伤情况，200倍镜下拍照。

2.5 炎症因子含量测定

行为学测试结束后，处死小鼠，解剖获得海马组织。称取相应质量的组织，加入10 倍量的PBS，低温研磨，离心20 min（2000 转/分），取上清液待测。按照ELISA 试剂盒所列步骤，测定小鼠海马中TNF-α、IL-6、IL-1β的水平。

2.6 氧化应激因子SOD、LDH、MDA测定

行为学测试结束后，处死小鼠，解剖获得海马组织。称取相应质量的组织，加入10 倍量的PBS，低温研磨，制成10%的组织匀浆。离心10 min（3000 转/分），取上清待测，按南京生物建成试剂盒说明书测定SOD和LDH的活力以及MDA的含量。

2.7 Nrf2、HO-1及凋亡蛋白表达测定

每组称取海马组织，记录重量，加入10 倍量的RIPA 裂解液与蛋白酶抑制剂cocktail（50:1），研磨后置于冰上裂解30 min，离心10 min 取上清。按照BCA试剂盒的操作步骤测定总蛋白含量，98℃加热15 min，使蛋白变性。用上海雅酶公司的10%和12.5%的蛋白凝胶试剂盒制备凝胶，120V 电泳2 h，Nrf2 转膜时间为2 h，Caspase-9、β-Actin 转膜时间为1h，Caspase-3、HO-1、Bax、Bcl-2 转膜时间为50 min，5%脱脂牛奶封闭2 h。结束后加入一抗（Nrf2 Rabbit mAb、HO-1 Rabbit antibody、Caspase-3 Rabbit antibody、Caspase-9 Mouse mAb、Bax antibody、Bcl-2 antibody，抗体比例均为1:2000；β-Actin Mouse antibody，抗体比 例为1:10000），4℃摇床过夜，二抗孵育（Anti-Mouse IgG，Anti-Rabbit IgG，HRP-linked Antibody，抗体比 例1:10000），室温孵育1h，洗膜后使用凝胶成像系统显色曝光。

2.8 数据统计与处理

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计分析，数据均使用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），单因素方差分析处理前数据经过正态分布检验。数据以P＜0.05 为有差异，P＜0.01有极显著差异。

3 结果

3.1 麋角丸对小鼠行为学的影响

3.1.1 麋角丸对Aβ1-42海马区注射小鼠学习与记忆行为的影响

Aβ1-42海马区注射小鼠给药10 天后，进行Morris水迷宫行为学测试。结果显示，与空白组小鼠比较，模型组小鼠潜伏期和上台前路程显著增加（P＜0.01），穿越平台次数显著减少（P＜0.01）。与模型组相比，麋角丸组小鼠潜伏期和上台前路程明显缩短，穿越平台次数显著增多（P＜0.05）（图2）。上述实验结果表明，麋角丸可明显改善Aβ 诱导小鼠受损的学习和记忆能力，高剂量组作用趋势优于低剂量组。

图2 麋角丸对Aβ1-42海马区注射小鼠水迷宫行为学的影响（n=11）

3.1.2 麋角丸对正常小鼠自发活动影响

正常小鼠给药10天后，进行旷场实验测试。结果显示，与空白组小鼠比较，麋角丸高低剂量组小鼠在5 min 内的总运动距离和旷场中心停留时间无显著性差异（图3）。结果表明，麋角丸对正常小鼠的自发活动无明显影响。

图3 麋角丸对正常小鼠自发活动影响（n=10）

3.2 麋角丸对Aβ1-42海马区注射小鼠海马DG 区脑片尼氏体染色的影响

对小鼠海马区脑片尼氏体染色发现，空白组海马DG 区细胞内尼氏体丰富，排列整齐紧密；而模型组小鼠海马齿状回区尼氏体减少，排列紊乱，细胞空泡化明显（P＜0.01）；与模型组相比，给药麋角丸组中，尼氏体数量增多，排列趋于整齐，细胞空泡化不明显（P＜0.05，P＜0.01）（图4）。实验结果表明，麋角丸对模型小鼠海马DG区神经元损伤具有保护作用。

图4 麋角丸对Aβ1-42海马区注射小鼠海马区脑片DG区尼氏体染色的影响（×200）（n=3）

3.3 麋角丸提取物对Aβ1-42海马区注射小鼠海马组织炎症因子表达水平的影响

ELISA 检测小鼠海马组织炎症因子表达水平结果显示，模型组小鼠海马中的TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量较空白组相比明显上调（P＜0.01），给予麋角丸提取物后，能明显下调模型组小鼠海马中炎症因子的表达水平（P＜0.05，P＜0.01）（图5）。麋角丸高剂量显示出较强的作用趋势。

图5 麋角丸对Aβ1-42海马区注射小鼠海马组织炎症因子表达水平的影响（n=8）

3.4 麋角丸对Aβ1-42海马区注射小鼠海马组织氧化应激因子的影响

小鼠海马组织氧化应激因子表达检测结果显示，与空白组相比，模型组小鼠海马组织中SOD 活性显著降低（P＜0.01），LDH 活性和MDA 含量显著提高（P＜0.01）。与模型组相比，麋角丸高、低剂量组均可提高小鼠海马中SOD 的含量（P＜0.01），降低小鼠海马组织中LDH 活性和MDA 的含量（P＜0.01）（图6）。因此，麋角丸提取物可减轻模型小鼠神经元的氧化损伤。

图6 麋角丸对Aβ1-42海马区注射小鼠海马组织氧化应激因子表达的影响（n=5）

3.5 麋角丸对Aβ1-42 海马区注射小鼠海马区Nrf2、HO-1蛋白表达水平的影响

Western Blotting 评价小鼠海马区Nrf2 与HO-1 蛋白表达水平结果显示，与空白组比较，模型组小鼠海马组织Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平降低（P＜0.05，P＜0.01），经过高低剂量的麋角丸作用后，小鼠海马中的Nrf2和HO-1蛋白表达水平升高，且呈剂量依赖性（P＜0.05，P＜0.01）（图7）。提示麋角丸提取物可能通过Nrf2/HO-1 通路发挥抗氧化作用保护神经元细胞免受损伤。

图7 麋角丸对Aβ1-42海马区注射小鼠海马组织Nrf2和HO-1蛋白表达水平的影响（n=5）

3.6 麋角丸对Aβ1-42海马区注射小鼠海马组织凋亡通路蛋白表达水平的影响

Western Blotting 法测试小鼠海马组织凋亡通路蛋白表达发现，与空白组比较，模型组小鼠海马Bcl-2/Bax 蛋白表达水平显著降低，Caspase-3、Caspase-9 表达水平明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。高、低剂量麋角丸不仅可以逆转小鼠海马中Bcl-2/Bax 蛋白的表达水平，而且可以显著降低模型组Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平（P＜0.05，P＜0.01）（图8）。这些结果表明，麋角丸提取物可减少模型小鼠海马区细胞凋亡。

图8 麋角丸对Aβ 海马区注射小鼠海马组织凋亡通路蛋白表达水平的影响（n=4）

4 讨论

AD的病理特征包括Aβ过度积累、tau蛋白过度磷酸化及氧化应激与中枢炎症等[10]。一般认为，Aβ 沉积和清除不平衡是引起AD 的源头，进而诱发记忆丧失和认知受损。Aβ 过度沉积会加快AD 患者体内神经炎症和氧化应激反应，从而导致神经元凋亡[11]。因此Aβ是AD发生与发展中的关键致病因素。

研究表明，AD 患者大脑都存在着海马神经元受损现象[12]，海马可被分为海马角（cornuammonis，CA）和齿状回（dentate gyrus，DG），这些区域都与学习记忆和空间认知功能相关。DG 区是海马信息的传入点，并且作为神经发生的关键区域，可终生形成新神经元，在空间信息编码以及学习记忆中起着重要作用[13]。Okada等人发现CA3病变并不影响实验鼠水迷宫实验的表现，而DG 区病变导致的水迷宫空间学习记忆障碍最为严重[14]。这与Kesner 等人发现DG 损伤导致的缺陷与完全海马损伤相似[15]。同时罗财妹等人发现AD 患者DG 区体积随着疾病的进程显著下降，猜测海马齿状回可能是AD 发病的重要位点[16]。尼氏体可反应神经元的功能情况，在正常状态下有固定的形态，而当神经元受损时，尼氏体会变得模糊或消失，因此可通过尼氏体的变化反映神经元的功能状态[17]。因此在本研究中选用了DG 区作为观察Aβ1-42海马区注射小鼠脑片尼氏体染色的影响，结果发现麋角丸作用后可增加DG 区尼氏体的数量，表明麋角丸对模型小鼠海马DG 区神经元损伤具有一定的保护作用。同时本研究考察了麋角丸对正常小鼠自发活动的影响，结果发现给药后与空白组小鼠相比总运动距离和旷场中心停留时间无明显差异，因此麋角丸改善Aβ 诱导小鼠受损的学习和记忆能力并非麋角丸引起的神经兴奋作用。

临床发现，AD 患者血清中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平明显升高。Aβ 沉积可激活AD 患者脑部小胶质细胞释放大量促炎细胞因子，如白细胞介素（IL-1β、IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF-α），从而引发炎症与免疫反应产生神经毒性[18]。同时Aβ 引起的炎性因子会加剧氧化应激反应，恶化AD 患者大脑神经元的氧化损伤[19]。氧化应激发生时脑组织中核转录因子NF-E2 相关因子2（Nrf2）/血红素氧合酶-1（HO-1）通路被激活，细胞内Nrf2 可产生明显的抗氧化作用，减少神经细胞的凋亡[20]。HO-1 是Nrf2 调控的最重要的抗氧化保护蛋白，Nrf2/HO-1 通路的激活可抑制氧化应激及淀粉样蛋白沉积，并导致学习和记忆功能的改善[21]。Aβ 诱发的氧化应激会在脑中产生过量活性氧（ROS），从而抑制抗凋亡因子2 型B 淋巴细胞（Bcl-2），并刺激促凋亡因子如Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）以及凋亡相关蛋白Caspase-3 和Caspase-9 的表达，诱导神经元凋亡[22]。因此，降低AD患者体内Aβ含量、减少患者体内的炎症反应以及氧化应激可能是治疗AD 的有效手段。

中医虽无AD 病名的记载，但其核心症状记忆障碍与认知损伤，可归为“好忘”“呆病”“痴证”等证[23]，中医认为AD 的病机在脑，但与肾的脏腑机能高度相关。中医理论主“肾藏志”，“志”是对神志活动的高概括，也是精神活动的集中体现。“肾藏精”，肾精是人生命的本原物质。老年人群年事日高，肾精亏虚，髓海失养，易出现认知障碍等神志活动异常现象[24]。因此补肾填精是中医用治AD 的重要治则治法。麋角丸出自唐代孙思邈《备急千金要方·卷十九肾脏·补肾第八》，是中医补肾著名方剂，原书用于治疗“五劳六极七伤虚损”。方中麋鹿角、肉苁蓉、菟丝子温肾阳，益精血；人参、甘草益气；秦艽，槟榔，木通祛风通络利湿。通补结合，补而不滞，功可“补心神、安脏腑、填骨髓”[25]。但是其现代研究未见报道，影响了该方的临床应用与现代开发。

本研究发现Aβ1-42海马区注射小鼠存在严重的记忆障碍，通过尼氏体染色发现模型小鼠海马DG 区出现神经元损伤，而麋角丸对其神经元损伤具有一定的保护作用。麋角丸可能通过下调海马区中枢炎症因子表达，调控氧化应激因子和Nrf2/HO-1 信号通路缓解海马组织氧化应激损伤，降低凋亡相关因子Caspase-3 和Caspase-9，提高Bcl-2/Bax 水平从而抑制小鼠海马神经元凋亡等途径改善模型小鼠的学习与记忆能力。已有报道显示，麋鹿角粉具有抗衰老、提高学习记忆等作用[26]。课题组前期研究发现，麋鹿角水提物具有显著抗抑郁效用，并可以下调抑郁模型动物血清和海马中压力因子和促炎物质的表达，上调模型动物脑中神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）的水平[27]。其他药味的有效成分如人参皂苷、甘草素均可改善阿尔茨海默症模型动物学习与记忆能力[28,29]。秦艽碱、槟榔碱、以及木通三萜皂苷也有抗炎、抗氧化等作用[30-32]。因此麋角丸改善Aβ1-42海马区注射小鼠学习与记忆能力的效用应是方中药味所含成分共同作用的结果。

中国是世界上阿尔茨海默病患者最多的国家，该病的社会成本构成了沉重的经济负担。制定切实有效的防治策略，并从传统药物中寻找治疗AD 的新药，将减轻AD 对家庭和社会造成的负担，有助于提高老年人的生活质量，形成一个健康的老龄化社会。本次研究中，首次发现麋角丸具有改善Aβ1-42海马区注射小鼠学习与记忆能力，在后续研究中，我们将深入探索麋角丸改善学习与记忆能力的作用机制与功效物质基础，以期为麋角丸的临床应用与产品开发提供更多的现代科学依据支持。