长链非编码RNA在单发及多发性子宫肌瘤中的表达及临床意义

黄晓莉，杨 慧，吴 玲，张春花，文海云，吴晓丽

(1.淮安市妇幼保健院妇产科，江苏 淮安 223002；2.南京医科大学附属妇产医院,江苏 南京 210004)

子宫肌瘤是育龄期妇女最常见的良性肿瘤，发病率呈逐年上升趋势，但病因尚不明确[1]。长链非编码RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)是自身不编码蛋白、转录本长度超过200nt的一类RNA分子[2]。研究表明，lncRNAs虽然不能直接转录翻译产生具有生物学活性的各类蛋白质，但其本身具有较强大的调控功能[3]。近年来，lncRNAs在子宫肌瘤临床预测、诊断和治疗中的作用日益受到重视，有研究将lncRNAs作为预测年轻子宫平滑肌瘤患者是否进展为静脉内平滑肌瘤病的生物学标志[4]。本研究旨在探讨lncRNAs在子宫平滑肌瘤中的表达及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究随机选取2016年1月至2020年12月于我院因单发、多发性(≥2个)子宫肌瘤入院行手术子宫肌瘤切除术(开腹、经阴道、腹腔镜)的25～50岁患者为研究对象，各100例。单发子宫肌瘤组患者平均年龄 39.7岁(25～50岁)，多发性子宫肌瘤组平均年龄43岁(27～50岁)。取样的子宫肌瘤直径均>5cm，选取其切除后或旋切术中留取的肿瘤瘤心为肌瘤组，选取内膜下1cm组子宫肌壁层为对照组，切除的标本组织存放于-80℃低温冰箱。本研究通过淮安市妇幼保健院伦理委员会审查，患者均知情同意。

1.2 lncRNAs的筛选

采用NONCODE科学数据库(网址为http://www.noncode.org)选取与子宫及子宫肌瘤组织相关的lncRNAs，从中筛选出子宫肌瘤相关研究尚未报道的lncRNAs：LINC00958、MIR4435、SNHG5。

1.3 研究方法

收集的临床样品首先抽提RNA，通过质检合格后，RNA逆转录为cDNA，将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增，其产物进行梯度稀释用于做标准曲线。实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)使用管家基因GAPDH(不同样品间表达量基本恒定)作为内参，以样品待测基因的值除以此样品内参的值，最终得到的比值为样品的待测基因相对含量。

1.3.1 RNA提取与质量检测

设计并合成qRT-PCR引物(表1)，引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG(SYBR®Green)的PCR反应的优化。取适量新鲜组织样品或正确保存的组织样品(50～100mg)，加入1mL的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen)，匀浆后抽提RNA。

表1 qRT-PCR的合成引物列表

采用紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，以计算其浓度并评估RNA纯度。使用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。按照逆转录酶(Invitrogen)使用说明将样品RNA逆转录为cDNA。

1.3.2相对定量实验

进行相对定量实验前，需将样品的目的基因及管家基因进行PCR扩增，对其产物进行梯度稀释，用以做标准曲线。将标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的qRT-PCR反应液中，进行qRT-PCR扩增和检测，其中TaqBeadTM热启动聚合酶来自Promega公司。对检测结果进行标准曲线分析，以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差，所得结果代表样品目的基因相对含量。得出qRT-PCR实验结果及相关图表。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 lncRNAs在四组标本中的表达比较

方差分析显示，LINC00958、MIR4435和SNHG5在单发性子宫肌瘤组、单发性子宫肌瘤对照组、多发性子宫肌瘤组、多发性子宫肌瘤对照组四组标本中表达量的差异均有统计学意义(F值分别是907.400、26.160、3.390，P<0.05)，见表2。

表2 lncRNAs在四组标本中的表达比较

2.2 lncRNAs在多发性子宫肌瘤患者两组标本中的表达

对单发性肌瘤组与对照组之间、多发性肌瘤组与对照组之间进行两两比较，结果显示LINC00958在单发、多发性肌瘤组中的表达(5.81×10-4±0.32×10-4、5.83×10-4±3.14×10-4)均低于其相应的对照组(1.23×10-3±0.75×10-3、1.88×10-3±0.40×10-3)，差异均有统计学意义(t值分别是79.690、32.080，P<0.05)；而MIR4435、SNHG5在单发、多发性肌瘤组中的表达与其相应的对照组之间无统计学差异(tMIR4435值分别是1.869、0.077,tSNHG5值分别是0.671、1.229，P>0.05)，见表3。

表3 lncRNAs在肌瘤组与对照组标本之间的两两比较

2.3 lncRNAs在单发性与多发性子宫肌瘤标本间的表达

对单发与多发性肌瘤组之间、单发与多发性肌瘤对照组之间进行两两比较，结果显示LINC00958、MIR4435、SNHG5单发与多发性肌瘤对照组之间的差异均有统计学意义(t值分别是15.910、6.342、2.717，P<0.05)；MIR4435在单发与多发性肌瘤组之间的差异有统计学意义(t=6.102，P<0.05)，而LINC00958、SNHG5在单发与多发性肌瘤组之间的差异均无统计学意义(t值分别是0.421、1.071，P>0.05)，见表4。

表4 3种lncRNAs在单发性与多发性子宫肌瘤标本之间的两两比较

3 讨论

3.1 常见的单发性子宫肌瘤和多发性子宫肌瘤存在不同

子宫肌瘤是育龄期妇女最常见的良性肿瘤，多见于30～50岁妇女，其诊断金标准为病理检查，病理类型以子宫平滑肌瘤为主，由平滑肌及结缔组织组成。子宫肌瘤的发病率呈逐年上升趋势，但其病因与发病机制尚未明确，可能与正常肌层的细胞突变、性激素及局部生长因子间的相互作用等有关[5]。临床上常见的肌瘤有单发性子宫肌瘤和多发性子宫肌瘤，相关文献报道单发性子宫肌瘤是由单克隆平滑肌细胞增殖而成，而多发子宫肌瘤是由不同克隆细胞形成[6]。本研究中单发与多发性肌瘤对照组之间的lncRNA LINC00958、MIR4435、SNHG5表达差异均有统计学意义。

3.2 lncRNAs在子宫肌瘤发生、发展过程中起作用

lncRNAs以往长期被认为是人类基因组中不具有生物学功能的“暗物质”；但近年研究发现，lncRNAs可以参与人类基因的转录激活和转录后调控，在染色质修饰及基因组印记等层面也同样能够起到调控作用[7]。某些特定的lncRNAs在特定的肿瘤细胞中可以检测出表达水平的改变，可作为肿瘤早期预防、诊断与治疗方面新的分子生物学标记及临床监测指标[8]。有研究采用高通量基因芯片技术方法检测子宫肌瘤组织与正常子宫肌层组织中lncRNAs的表达情况，以期阐明lncRNAs 在子宫肌瘤发生、发展过程中的作用机制，为患者个体化基因治疗提供理论依据[9]。

3.3 lncRNALINC00958、MIR4435、SNHG5在单发性和多发性子宫肌瘤中的表达

lncRNA LINC00958定位于人染色体11p15.3，参与八类肿瘤的表达上调，包括肝细胞肝癌、子宫颈癌、鼻咽癌、头颈鳞状细胞癌、口腔鳞状细胞癌、胃癌、膀胱癌、神经胶质细胞瘤等，且与肿瘤患者的临床病理分期以及肿瘤转移相关[10,11]。LINC00958被广泛研究报道为促癌基因，用于肿瘤的临床预防、诊断、治疗的新靶标，但其在子宫内膜癌的研究中被发现为抑癌基因[12]；而lncRNA LINC00958在子宫肌瘤组织中的表达尚无研究报道。子宫肌瘤虽然大多数是良性肿瘤，但也存在类似于恶性肿瘤的细胞增殖、种植、复发等情况[13]。进一步研究LINC00958在子宫肌瘤中的作用，可以为临床预测子宫肌瘤的发生、发展提供依据。本研究发现，LINC00958在单、多发性肌瘤组中的表达均低于其相应的对照组表达，差异均有统计学意义。

MIR4435-2HG定位于人2号染色体长臂，研究表明其与卵巢癌、乳腺癌、胃肠癌和头颈部肿瘤等有关[14-16]。Ouyang等人研究发现MIR4435-2HG可能通过P38/MAPK和VEGF途径参与恶性肿瘤的发展[17]。MIR4435-2HG在子宫肌瘤组织中的表达尚无文献报道，本研究发现其在单发与多发性肌瘤组之间的差异有统计学意义，但在单发及多发性子宫肌瘤标本中的MIR4435表达量与其对照组比较均无统计学差异。

SNHG5是核仁小分子非编码RNA宿主基因家族成员之一，定位于人6q15染色体，与乳腺癌、鼻咽癌、食管癌、骨关节炎等相关[18-20]。相关研究发现，SNHG5通过SNHG5/miR-25-3p/BTG2轴在子宫内膜癌的发生发展中起着重要作用[21]。此外，SNHG5还可通过负调控miR-132，促进SOX4表达，从而促进子宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭[22]。SNHG5在子宫肌瘤组织中的表达尚无文献报道，本研究发现其在单发及多发性子宫肌瘤标本中的表达量均无统计学差异。

综上所述，本课题通过NONCODE科学数据库筛选出与子宫及宫颈组织相关的lncRNA LINC00958、MIR4435、SNHG5，发现LINC00958在单发及多发子宫肌瘤标本中的表达量均显著低于肌瘤旁组织，为揭示子宫肌瘤lncRNA通路的发病分子机制，及子宫肌瘤的预测与治疗提供了新线索。未来应进一步研究LINC00958如何在子宫肌瘤的发病过程发挥抑制作用，可通过检测LINC00958的表达划分高危人群，预测子宫肌瘤的发生。此外，以LINC00958为靶点，还可指导子宫肌瘤治疗方法的选择与应用。