放射性核素标记的小分子FAP抑制剂的应用研究进展

刘敬如，芮建中，朱 虹

(1.东部战区总医院 核医学科，江苏 南京 210002；2.东部战区总医院 临床药学科，江苏 南京 210002)

恶性肿瘤一般增殖迅速，易发生转移，还会产生有害因子破坏正常组织器官的结构和功能，使机体功能失调进而威胁生命。虽然不同类型肿瘤的发生部位、细胞分化程度和转移程度都不同，但通过免疫组化染色证明在超过90%的人类上皮癌活性基质纤维细胞中都检测到成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein, FAP)的高表达，如卵巢癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌等[1-5]。然而，FAP在正常组织和良性肿瘤中一般并不表达[6]。特殊情况下FAP在正常组织中的表达仅限于：(1) 部分胰腺内分泌细胞中可见；(2) 愈合伤口的肉芽组织中短暂可见；(3) 在慢性炎症和细胞纤维化相关疾病中可见，如风湿性关节炎和肺纤维化等[7]。以上研究表明，FAP可作为肿瘤早期预防诊治的特异性靶标，采用放射性核素标记FAP抑制剂作为活体分子功能影像诊断和核素靶向治疗对临床上肿瘤的诊治具有重大意义。

FAP是一种属于脯氨酸寡肽酶家族的Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶，常见形式为95 kDa的无活性单体或相对分子质量为170 kDa的有活性同型二聚体，具有二肽基肽酶和内肽酶活性[8-10]。作为二肽基肽酶家族主要成员之一，FAP 不仅与同家族的二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidyl peptidases Ⅳ, DPP-Ⅳ)具有相同的结构域，且在完整的氨基酸序列中有48%的相同氨基酸，但FAP具有独特胶原酶活性，可以裂解明胶、变性的Ⅰ型胶原和Ⅳ型胶原[11]，DPP-Ⅳ则不具备。尽管如此，在设计FAP抑制剂时仍要考虑靶向选择性，避免FAP抑制剂对DPP-Ⅳ的抑制活性。

目前，已有大量研究表明，FAP可参与多种肿瘤促生长活动，如基质重塑、血管生成、侵袭和迁移等。肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)是肿瘤微环境的重要组成部分，在肿瘤的侵袭和转移中起着重要的作用，其主要特征是FAP的高表达。Wang等[12]研究发现FAP在胃癌的CAF中高表达且与胃癌的网膜转移呈正相关(P<0.05,R2=0.273 6,P<0.05,R2=0.147 9)，而siRNA介导的FAP敲除则会显著抑制人胃癌细胞系MGC-803细胞的侵袭和迁移。Chen等[13]发现在胶原纤维成纤维细胞的表面有一种由FAP和DPP-Ⅳ形成的复合物可以在细胞侵袭过程中与明胶结合并溶解明胶来促进细胞迁移。Huang等[14]研究发现在小鼠乳腺癌移植模型中，FAP高表达组的肿瘤生长速度和血管丰富程度远超FAP未表达组。综上，鉴于FAP在肿瘤促生长活动中的重要角色，FAP靶向抑制剂在肿瘤诊治中的应用成为研究热点。FAP靶向抑制剂主要可分为抗体类和合成小分子类，本文主要对这两类FAP抑制剂的研究进展进行综述。

1 单抗类FAP抑制剂

131I-mAbF19作为第一代FAP-单抗，与FAP具有很高的亲和力[15]，然而，较大的相对分子质量使得抗体分子在体内的清除缓慢，导致本底信号高，进而影响图像质量，因此131I-mAbF19没有得到进一步应用[16]。Fischer等[17]将ESC11和ESC14改造为IgG1抗体并以177Lu进行标记，实验结果显示，二者能够选择性地与人和小鼠FAP结合，其亲和力低于纳摩尔。其中177Lu-ESC11能在黑素瘤异种移植模型中特异性摄取，可明显延长荷瘤小鼠的存活期。可见，ESC11和ESC14有潜力成为靶向FAP的放射免疫偶联物或抗体-药物偶联物。

2 小分子类FAP抑制剂

目前在研的FAP抑制剂多为合成类小分子，临床尚没有靶向FAP的肿瘤诊治药物上市。虽然当前对小分子FAP抑制剂的抗肿瘤作用机制尚不明确，但FAP可参与多种肿瘤促生长活动，如基质重塑、血管生成、侵袭和迁移等已经得到证实。Cheng等[18]研究表明，抑制肿瘤细胞内FAP的高表达会显著促进肿瘤的生长。Dong等[19]研究表明：Polyphyllin Ⅰ可通过下调体内CAFs中FAP和肝细胞生长抑制因子(hepatocyte growth factor, HGF)的表达来抑制胃癌细胞的增殖。Gunderson等[20]通过使用新型小分子抑制剂UAMC-1110结合局部放疗和抗PD-1免疫治疗对胰腺导管腺癌进行体外研究，研究结果显示，FAP缺失与抗原特异性肿瘤T细胞浸润能力的改善和胶原沉积的增加相关，靶向FAP或CAF的放射治疗能明显增强抗肿瘤T细胞浸润能力。但是，靶向FAP和CAF与放疗结合并不会使肿瘤清除率增加而延长生存期。

Val-boroPro(Talabostat, PT-100)是首个进入临床的小分子FAP抑制剂。临床前研究表明，Val-boroPro对淋巴瘤、黑素瘤、肥大细胞瘤和纤维肉瘤异种移植模型中肿瘤的生长均有抑制作用[21]。临床研究表明，Val-boroPro对非小细胞肺癌、结直肠癌、肾癌、胰腺癌等多种肿瘤均有抑制作用，目前已经进入临床Ⅲ期研究。但Val-boroPro不仅对FAP表现出明显的抑制作用，对DPP-Ⅳ、DPP8和DPP9也具有很强的抑制作用[22]，这表明Val-boroPro的靶向选择性不高，其原因在于Val-boroPro结构中的硼酸基团对丝氨酸蛋白酶亚家族中的S9B蛋白酶具有较强的亲和力[23]。

Ryabtsova等[24]对PT-100进行修饰，以亲电性相对温和的氰基取代PT-100中的硼酸基团并保留原有的二肽结构设计合成了一系列以N—酰基—甘氨酰—(2-氰基)吡咯烷为骨架的FAP抑制剂。相较于PT-100而言，该类目标分子不存在碱性P2-胺功能团，因此对所有种类的二肽基肽酶均未显示出可测量的亲和力。其中化合物6、19、33～35(图1)均表现出较优异的靶向选择性，对FAP的IC50值分别为(3.5±0.1)、(0.67±0.04)、(0.126±0.007)、(0.85±0.07)、(0.110±0.007) μmol/L，对DPP-Ⅱ和DPP-Ⅳ的IC50值均大于100 μmol/L，对DPP9的IC50值除化合物6((S)-N-(2-(2-氰基吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)苯甲酰胺)(图1)是大于100 μmol/L外，其他几个化合物均大于10 μmol/L。同时，本研究还系统地考察了N-酰基上取代基的不同和2-氰基吡咯烷残基上4-位取代基的不同对选择性及亲和力的影响。构效关系(structure activity relationship, SAR)研究显示：(1) FAP的P3区域(预计可容纳N-酰基上的取代基)对取代基的刚性没有严格要求，其中含有1-萘甲酰基的化合物19((S)-N-(2-(2-氰基吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-1-萘甲酰胺)(图1)对FAP抑制活性最为突出；(2) 在(2-氰基)吡咯烷基在的4-位以4R或4S-叠氮基、甲基、亚甲基、乙基和4R-三氟甲基等取代相比于化合物6和19(图1)均显示出较低的抑制活性。但在该位点以单氟或双氟取代化合物33～35 (N-(2-((2S，4S)-2-氰基-4-氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-1-萘甲酰胺、(S)-N-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)苯甲酰胺和(S)-N-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-1-萘甲酰胺)(图1)则显示出高于该位点未取代的化合物更好的FAP抑制活性，其原因可能是氟原子增加了分子的亲酯性；(3) 关于FAP/脯氨酰寡肽酶(prolyl oligopeptidase, PREP)选择性问题，PREP S1口袋中的可用空间似乎比FAP还要有限：仅在氟化化合物的情况下，引入4-取代基并不能完全消除化合物对PREP的亲和力。

Jansen等[25]以PT-100和DPP-Ⅳ抑制剂Linagliptin(具有一定的FAP亲和力)[26]为参考设计合成了一系列新的(2-氰基)吡咯烷类FAP抑制剂。该研究发现在甘氨酰侧链部分以N-(4-喹啉基)取代的化合物7((S)-N-(2-(2-氰基吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)喹啉-4-甲酰胺)(图1)比Ryabtsova等报道的化合物19((S)-N-(2-(2-氰基吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-1-萘甲酰胺)(图1)具有更高的FAP亲和力(IC50=0.010 3 μmol/L vs IC50=0.67 μmol/L)。同时，他们还探索了喹啉环上SP2杂化的N原子位置的改变对FAP亲和力和选择性的影响，构效关系研究表明N-(4-喹啉基)残基是决定FAP亲和力的关键基团。目前可以确定FAP和4-喹啉基环间并非为阳离子-π相互作用，但具体地相互作用模式未知。此外，对4-喹啉基环上取代基的位置进行改变，发现当取代基在5位时，化合物对FAP的亲和力最高，如化合物25((S)-5-氯-N-(2-(2-氰基吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)喹啉-4-甲酰胺)和化合物26((S)-5-溴-N-(2-(2-氰基吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)喹啉-4-甲酰胺)(图1)对FAP的IC50分别为(0.009 9±0.000 3) μmol/L和(0.011±0.000 4) μmol/L且二者对于PREP和DPP均具有很高的选择性(SI[FAP/DPP]>103,SI[FAP/PREP]>103)。初步药代动力学(absorption, distribution, metabolism, excretion, ADME)实验表明，该类化合物具有优异的血浆稳定性、动力学溶解度和logD。化合物7在小鼠血浆内的稳定性大于24 h，pH为7.4时，其溶解度大于200 μmol/L，logD为0.51。化合物26在人血浆的稳定性大于24 h，pH为7.4时，其溶解度大于200 μmol/L，logD为0.7。

图1 PT-100及其氰基取代的衍生物

Loktev等[27]对喹啉类FAP特异性抑制剂(fibroblast activation protein inhibitor, FAPI)进行结构优化，引入放射性核素131I和螯合剂1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(1,4,7,10-tet-raazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid, DOTA)得到了小分子示踪剂FAPI-01和FAPI-02(图2)。通过摄取、竞争结合、流式细胞检测以及荧光标记等体外实验对FAPI-01和FAPI-02进行评估，结果显示，131I标记小分子FAPI-01在脱碘酶的作用下会有游离碘流出结构不稳定，且孵育时间较长导致细胞内的放射性减低。而非卤素衍生物FAPI-02引入螯合剂DOTA，提高了整个分子的稳定性，使得FAPI-02的消除速度明显慢于FAPI-01，24 h后的放射性为初始累积量的12%(FAPI-01仅为1.1%)。在荷瘤小鼠及首个癌症患者体内的生物分布研究均表明，FAPI-02具有很高的瘤内摄取量和快速的体内清除率，可以得到高对比度图像且对健康组织的辐射暴露可忽略[27]。在局部晚期肺腺癌患者中首次将68Ga-FAPI-02与18F-FDG进行比较，其结果显示与18F-FDG相比68Ga-FAPI-02在脑、脾和肝中均无吸收，仅在FAP高表达的组织中快速累积。该对比研究再次表明68Ga-FAPI-02具有优异的靶向作用，但FAPI-02在体内的保留时间较短限制了其临床应用。

通过对FAPI-02进一步优化，Lindner等[28]设计合成了11个新的喹啉类FAPI。其中，以4,4-二氟脯氨酸取代的FAPI-04(图2)被认为是最具有临床应用前景的示踪剂，这一点与上文中提到的具有4,4-二氟脯氨酸取代基的化合物35(图1)同样具有FAP高亲和力完全一致[24]。虽然FAPI-04的EC50值与FAPI-02相比仅降低了3倍(6.5 nmol/L∶21 nmol/L)，但FAPI-04的靶向选择性明显提高(FAP/DPP-Ⅳ比为750∶45)。荷瘤小鼠PET显像及生物分布研究表明，FAPI-04在体内的积累量更高、保留时间更长且本底放射性没有显著增加。构效关系研究表明，FAPI-04中的哌嗪杂环片段使得酶促分解反应不易进行，是示踪剂在肿瘤细胞内长时间保留所必须的结构。与FAPI-04相比，FAPI-13(图3)则显示出更高的肿瘤摄取值。但FAPI-13在血液中的保留也较高，使得肿瘤/血液比较低，其原因可能是分子中的哌啶结构使得示踪剂具有较高的亲脂性和组织渗透性可以与血清蛋白发生非特异性结合[29-30]。将FAPI-04初步用于两名转移性乳腺癌患者的诊治， PET/CT显像显示FAPI-04在各部位转移病灶中均能快速累积，SUVs在7～29.9之间，主要经肾脏快速代谢。此外，进一步以治疗性核素90Y对FAPI-04进行标记并用90Y-FAPI-04治疗1例晚期转移性乳腺癌患者，单次注射2.9 GBq 即可显著改善症状，且没有观察到副作用，特别是在血液毒性方面。

图2 FAPI-01，FAPI-02和FAPI-04的结构

Giessel等[31]对FAPI-02和FAPI-04进行了初步的体内组织分布和计量学特点的研究。主要考察了FAPI-配体在患者体内的组织分布和肿瘤内吸收并与18F-FDG进行对比。实验结果表明，68Ga-FAPI-PET/CT是一种有希望的新型诊断方法，适用于胰腺癌、头颈癌、结肠癌、肺癌、肝癌和乳腺癌显像，尤其是肝癌和胰腺癌，18F-FDG对这两种肿瘤显像具有局限性，目前尚无特异性PET显像药物[32-33]。 FAPI-配体的肿瘤/本底摄取比值与18F-FDG几乎相等，且在肝、脑和口腔黏膜等特定组织中摄取较少。 FAPI-配体的优势在于：(1) 快速示踪动力学，注射10 min后即可快速显像，增加患者的舒适度，简化临床工作流程；(2) 在肝脏、脑和口腔黏膜吸收低，有望用于肝、脑肿瘤及其他肿瘤的肝、脑转移检查；(3) 患者能否进行检查与血糖水平无关，不受饮食限制。但是，由于在伤口愈合组织中也有成纤维细胞被激活，进而使得一定量的FAPI在伤口愈合组织中被摄取，因此，当前研究尚不认为FAPI是一种比FDG更具有肿瘤特异性的PET示踪剂[34]。

Kiatochwil等[35]量化了FAPI-04在各种原发性和转移性肿瘤中的摄取，以确定其在临床应用中更适用于哪种肿瘤类型。80位入选患者均是由不同的临床医师根据18F-FDG-PET/CT或其他影像学检查无法满足检查需求的患者，患者均在注射68Ga-FAPI-04(122～312 MBq)1 h后进行PET/CT显像，通过SUVmax和SUVmean(60%等高线)量化肿瘤的摄取。研究发现FAPI-04在肉瘤、食管癌、乳腺癌、胆管癌和肺癌中的摄取水平最高(平均SUVmax>12)；在嗜铬细胞瘤、肾细胞瘤、分化型甲状腺癌、腺囊性癌和胃癌中的摄取水平最低(平均SUVmax<6)；在肝细胞癌、结直肠癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌中的摄取水平中等(平均SUVmax为6～12)。由于68Ga-FAPI-04的肌肉和血池本底很低(SUVmax<2)，即使在中等强度摄取组肿瘤/本底摄取比值也大于3倍，而在高强度摄取组肿瘤/本底摄取比值高达6倍以上。

Watabe等[36]使用较长半衰期的核素64Cu(T1/2=12.7 h)和225Ac(T1/2=10 d)对FAPI-04进行标记，以评估其在FAP高表达的人胰腺癌异种移植模型(PANC-1异种移植模型和MIA PaCa-2异种移植模型)中的延迟摄取情况，并以68Ga-FAPI-04作为对照。在PANC-1异种移植模型中的动态PET显像显示，64Cu-FAPI-04通过肾脏的快速清除且从肿瘤中的清除缓慢。延迟PET显像显示，64Cu-FAPI-04在肿瘤中摄取量中等，而在肝脏和肠道中的摄取量则相对较高。除心脏外，64Cu-FAPI-04在肿瘤或正常器官中的蓄积水平明显高于68Ga-FAPI-04，而68Ga-FAPI-04在尿液中的排泄量高于64Cu-FAPI-04。体外细胞摄取分析显示，64Cu-FAPI-04在PANC-1和MIA PaCa-2肿瘤细胞中的蓄积极少。225Ac-FAPI-04在注射后3～24 h内可肿瘤内观察到中等程度的洗脱，但在肝脏、肾脏和肿瘤(PANC-1异种移植模型)仍具有较高的摄取量。与对照组小鼠相比，注射225Ac-FAPI-04的PANC-1异种移植小鼠表现出显著的肿瘤生长抑制，且体重没有显着变化。该研究表明，64Cu-FAPI-04和225Ac-FAPI-04可用于治疗FAP高表达的胰腺癌。

为了进一步提高FAPI在肿瘤内的吸收和保留，Loktev等[37]对FAPI-04进行修饰，设计合成了15个新的喹啉类FAPI衍生物并分别以68Ga和177Lu进行标记。体外细胞实验结果显示，与FAPI-04相比，大多数衍生物在24 h后显示出更高的摄取量与更慢的消除速率，尤其是FAPI-21和FAPI-46(图3)，孵育4 h后仍可在FAP高表达的细胞内检测到初始活性的74%和65%，而FAPI-04仅为初始活性的25%。从结构上看，尽管以不易降解的DOTA-二氮杂双环庚烷取代FAPI-04中的DOTA-哌嗪环可能是FAPI-21的排泄速度比FAPI-04慢的原因，但与FAPI-04具有相同DOTA-哌嗪结构的FAPI-46在瘤内保留时间则比FAPI-04更长。这表明FAPI示踪剂从细胞内消除是多个过程的相互作用的结果，目前尚无定论。为了进一步评估68Ga标记的衍生物的潜在肿瘤保留率及药代动力学行为，他们在HT-1080-FAP异种移植小鼠中进行了PET显像研究。结果显示，有7种衍生物在荷瘤小鼠中的肿瘤摄取值高于FAPI-04(SUVmean=58.02)，以FAPI-21(SUVmean=92.59)、FAPI-36(SUVmean=86.74)、FAPI-46(SUVmean=79.63)和FAPI-55(SUVmean=106.20)最为突出。值得注意的是，示踪剂68Ga-FAPI-21和68Ga-FAPI-46的肿瘤与血液、肝脏、肌肉和肠道的吸收比率得到了显著改善。在癌症患者中的初次诊断应用显示，在给药后10 min内，68Ga-FAPI-21和68Ga-FAPI-46均在肿瘤内显示较高的摄入量，尤其是68Ga-FAPI-46不仅保留了与FAPI-04相似的显像对比度，肿瘤滞留时间也进一步延长[38]，但68Ga-FAPI-21在口腔粘膜，唾液腺和甲状腺中的也显示较高的摄取[38]。在此基础上又用177Lu对FAPI-21、FAPI-36、FAPI-46和FAPI-55进行标记，结果显示，均具有较强的肿瘤累积且在健康组织中吸收较低，尤其是FAPI-46能显著改善肿瘤与肝、肾和脑的摄取比率。

图3 FAPI-13，FAPI-21，FAPI-46和FAPI-55的结构

目前基于喹啉结构的FAPI显像剂多采用68Ga 标记，如68Ga 标记的FAPI-04标记率可达89%±0.8%，放化纯度大于95%，比活度为25～30 GBq/μmol[39]，但该类FAPI无法用18F直接标记，且以68Ga标记时通常需要加热。Giesel等[40]对现有的FAPI进行修饰得到代表性的化合物FAPI-74(结构尚未公开)并以18F-AlF(氟化铝)和冷套68Ga标记。该研究主要评估了18F-FAPI-74 PET在肺癌患者体内的生物分布和辐射剂量，并证明了其对指导放射治疗的可能价值。此外，该研究建立了68Ga-FAPI-74在室温下标记的方法，并用与18F-FAPI-74相同的方法评估了其体内性能。分别对10名肺癌患者注射68Ga-和18F-FAPI-74，1 h后图像采集显示二者均可在有限噪声下获得最佳的肿瘤/本底比。就辐射剂量而言，18F-和68Ga-FAPI-74每100 MBq的平均标准化有效剂量仅为(1.4±0.2) mSv和1.6 mSv，对患者的辐射负担较低。

3 小结与展望

本文主要分析了一些代表性的FAP抑制剂在肿瘤诊治方面的设计思路、相互关联以及研究进展。喹啉类FAPI骨架主要经过三个过程的结构修饰：(1) 以PT-100为代表的硼酸吡咯烷结构骨架；(2)N-(4-喹啉基)和(2-氰基)吡咯烷连接的结构骨架；(3) DOTA螯合剂、连接链、N-(4-喹啉基)和(2-氰基-4,4-二氟)吡咯烷连接的结构骨架。目前，关于FAP抑制剂的探索主要偏向于以诊断性核素68Ga标记的小分子，同时以64Cu、225Ac和18F等诊断性核素标记的FAPI也相继引起研究者的关注，但以治疗性核素177Lu和90Y等标记的治疗性小分子研究较少。从结构上看，与18F-FDG相比，放射性核素标记的FAP抑制剂含有螯合剂DOTA，一方面可以和多种放射性核素络合，另一方面增加了结构的稳定性。同时，鉴于68Ga-FAPI-PET/CT显像具有良好的肿瘤特异性、较高的肿瘤/本底比以及不受糖代谢影响等优点，68Ga-FAPI有望成为继18F-FDG后另一种可用于多种类型肿瘤诊断的放射性药物。但当前FAPI-PET/CT检查用于每种肿瘤患者的研究数量有限，尚不允许对组织学变异或分化等级进行亚组分析，接下来，尚需多中心、长期、大样本临床数据作为诊断效果和预后评估的基础。此外，FAP不仅在肿瘤细胞中高表达，在其他炎症组织和纤维化疾病中也有所表达，这对FAPI-PET/CT检查的准确率有很大的影响。综上所述，FAP抑制剂作为肿瘤靶向诊治的手段在临床应用尚需投入更多的研究。