不同精粗比日粮对山羊组织脂肪酸合成和代谢相关基因表达的影响

占今舜，詹 康，钟小军，霍俊宏*

（1.江西省农业科学院 畜牧兽医研究所，江西 南昌 330200；2.扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009）

肌内脂肪含量是衡量肉品质的主要指标之一，它与肌肉的多汁性、剪切力、嫩度和风味等品质性状有关［1］。肌内脂肪沉积与脂肪酸摄取、脂肪合成和代谢有关，受畜禽品种、年龄和日粮营养水平等因素的调控［2］。杨金丽等［3］研究发现，相对于秸秆精料日粮（精粗比5∶5），青干草精料日粮（精粗比7∶3）能够促进蒙古羔羊腿部乙酰辅酶A羧化酶ɑ、脂联素和瘦素基因的表达，青干草精料日粮能够促进羔羊腿部脂肪的合成。占今舜等［4］研究发现，采食精粗比70∶30日粮的犊牛肝脏、十二指肠和瘤胃中的SREBP1和ApoA mRNA相对表达量显著高于采食精粗比60∶40日粮的；采食精粗比75∶25日粮的犊牛肝脏和十二指肠中的FASN mRNA相对表达量显著高于采食精粗比65∶35日粮的，而FASN mRNA在瘤胃和肌肉中的相对表达量则相反；SCD1 mRNA在采食精粗比75∶25日粮的犊牛肝脏和十二指肠中的相对表达量最高。以上结果表明，不同精粗比日粮能够影响反刍动物体内脂肪合成相关基因的表达，进而影响体内脂肪的合成。背膘和肋肉越厚，说明脂肪沉积越高。笔者在前期研究中发现，提高日粮的精粗比水平能够提高山羊背膘厚和肋肉厚，说明提高日粮的精粗比能够促进脂肪沉积［5］。鉴于此，研究了不同精粗比日粮对山羊组织脂肪酸合成和代谢相关基因表达的影响，旨在明确日粮影响山羊脂肪沉积是否与其调控组织脂肪酸合成和代谢相关基因的表达有关。

1 材料与方法

1.1 试验设计和饲养管理

试验选取36只体重相近且健康的努比亚山羊（母羊），将它们随机分成3组，每组12只羊。试验羊分别饲喂精粗比为40∶60（精料低水平，L组）、50∶50（精料中水平，M组）和60∶40（精料高水平，H组）的全混合日粮，自由饮水。试验于2018年11月在九江市修水县大业牧业有限公司肉羊养殖场开始，于次年1月份结束，整个试验为期70 d，其中预饲期为14 d，正试期为56 d。试验日粮在等蛋能比和钙磷比下，参照NY/T 816─2004《中国肉羊饲养标准》进行配制，其营养水平见表1。采用圈养方式饲养试验羊，每天早上8∶00和下午17∶00进行饲喂；其他饲养管理按照养殖场的规定。

表1 不同处理的日粮组成与营养水平（干物质基础）

1.2 组织样品的采集

在试验结束后，每组选择体重相近的6只山羊进行屠宰，屠宰后取出肝脏，剪取一小块肝脏放入冻存管中，然后放入液氮中保存；另外剪取瘤胃和小肠组织，用生理盐水冲净内容物后放入液氮中；最后将组织转运至实验室，在-80 ℃下冷冻保存，待测。

1.3 组织RNA的提取和合成

将山羊组织放在液氮中研磨粉碎，然后取50~100 mg粉碎的组织，加入1 mL的Trizol，混匀，静置5~10 min；根据天根生化科技有限公司RNA提取试剂盒说明书中的步骤进行RNA提取。在RNA提取结束后，用One Drop仪器对组织RNA的浓度和纯度进行检测。采用诺唯赞生物试剂盒进行cDNA的合成，按照试剂盒说明书配制20 μL的反应体系；反应条件为50 ℃ 15 min，85 ℃ 2 min；合成获得的cDNA在-20 ℃下保存，待测。

1.4 引物设计和Real Time-PCR检测

参照GenBank中的基因序列，用Primer 5.0软件设计引物，引物合成由Invitrogen公司完成。引物序列见表2。按照诺唯赞生物RT-PCR试剂盒说明书中的方法配制20 μL的PCR反应体系，在Light Cycler®96 PCR仪（Roche公司）上进行PCR检测。PCR反应条件为：预变性95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。溶解曲线的反应条件为：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

表2 引物序列与参数

1.5 数据统计与分析

先用EXCEL 2016对试验数据进行初步处理，根据2-ΔCt来计算目的基因的相对表达量。然后，采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析，用LDS法进行差异多重比较。数据分析结果以平均值±标准误表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同日粮对山羊组织ACOX1 mRNA表达的影响

由表3可知：ACOX1 mRNA在山羊肝脏和瘤胃中的表达量较高，在肠道中的表达量较低；ACOX1 mRNA在M组山羊瘤胃中的表达量显著低于其他两组（P<0.05），在L组山羊空肠中的表达量显著高于H组（P<0.05）；在山羊肝脏和十二指肠中ACOX1 mRNA的表达量在各组间无显著差异（P>0.05）。

表3 不同日粮对山羊组织ACOX1 mRNA表达量的影响

2.2 不同日粮对山羊组织CPT1A mRNA表达的影响

从表4中可以看出：CPT1A mRNA在山羊肝脏中的表达量较高，在瘤胃、肠道中的表达量较低；CPT1A mRNA在L组山羊瘤胃中的表达量显著高于其他两组（P<0.05），在M组山羊十二指肠中的表达量显著高于其他两组（P<0.05）；但在山羊肝脏和空肠中CPT1A mRNA的表达量在各组间无显著差异（P>0.05）。

表4 不同日粮对山羊组织CPT1A mRNA表达量的影响

2.3 不同日粮对山羊组织PPAR-γ mRNA表达的影响

由表5可见：PPAR-γmRNA在山羊肠道中的表达量较高，在肝脏和瘤胃中的表达量较低；PPAR-γmRNA在L组山羊瘤胃中的表达量显著高于其他两组（P<0.05），在H组山羊十二指肠中的表达量显著高于其他两组（P<0.05），但在肝脏和空肠中的表达量在各组间无显著差异（P>0.05）。

表5 不同日粮对山羊组织PPAR-γ mRNA表达量的影响

2.4 不同日粮对山羊组织ACACA mRNA表达的影响

从表6可以看出：ACACA mRNA在山羊瘤胃中的表达量较高，在肝脏中的表达量较低，但在肠道中未检测出；ACACA mRNA在M组山羊肝脏中的表达量显著高于其他两组（P<0.05），而在瘤胃中的表达量显著低于其他两组（P<0.05）。

表6 不同日粮对山羊组织ACACA mRNA表达量的影响

2.5 不同日粮对山羊组织FASN mRNA表达的影响

如表7所示，FASN mRNA在山羊肝脏中的表达量较高，在瘤胃中的表达量较低，但在肠道中未检测出；FASN mRNA在L组山羊肝脏中的表达量显著低于其他两组（P<0.05），而在瘤胃中的表达量显著高于其他两组（P<0.05）。

表7 不同日粮对山羊组织FASN mRNA表达量的影响

3 讨论

酯酰辅酶A氧化酶（ACOX）是过氧化物酶体脂肪酸β-氧化过程中脱氢反应的限速酶，将酯酰辅酶A催化成α，β-反式烯酰辅酶A［6］。ACOX家族有3种亚型，即ACOX1、ACOX2和ACOX3，它们参与过氧化物酶代谢和糖代谢，与脂肪酸代谢及甘油三酯沉积密切相关［7］。研究发现，增加ACOX1基因的表达量能够促进脂肪酸的代谢，减少甘油三酯的沉积［8］。本试验结果表明，用低精粗比日粮喂养的山羊组织中的ACOX1 mRNA表达量较高，说明低精粗比日粮有助于脂肪酸的代谢，降低甘油三酯的沉积。另外，ACOX1 mRNA在空肠中的表达量随日粮精粗比的升高而呈降低趋势，说明提高日粮的精粗比不利于脂肪酸在山羊空肠中的代谢。

肉碱脂酰转移酶1（CPT1）是脂肪β-氧化的限速酶，它能够催化酯酰辅酶A在线粒体内膜进行β-氧化，从而使脂肪沉积减少［9］。CPT1一般存在CPT1A、CPT1B和CPT1C这3种亚型基因。在机体内，CPT1A能够携带长链脂肪酸进入细胞膜，促进脂肪酸β氧化，进而减少脂肪的沉积［10］。据报道，CPT1A基因在山羊肝脏中的表达量要高于在其他组织中的表达量［11］，本试验结果与此结果一致。据报道，与低精粗比日粮相比，高精粗比日粮能够显著降低奶牛肝脏的CPT1A mRNA的丰度［12］，本试验结果与此不同，可能是由品种不同造成的。本研究还发现，CPT1A mRNA在低精粗比日粮组山羊瘤胃中的表达量显著高于其他两组的，在中精粗比日粮组山羊十二指肠中的表达量显著高于其他两组的，说明低精粗比日粮能够促进脂肪酸在山羊瘤胃中的β氧化，而中精粗比日粮有助于促进脂肪酸在十二指肠内β氧化。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）在脂肪组织中的表达量较高，是脂肪细胞分化的主要调节因子，在分化过程中能够调节脂肪形成并调控脂质代谢［13］。PPAR-γ基因在不同组织中的表达存在差异。在本试验中，PPAR-γ基因在山羊肠道组织中的表达量较高，在瘤胃和肝脏中的表达量较低。PPAR-γ在与其配体结合后才能激发其活性，进而发挥作用。内分泌因子、不饱和脂肪酸及其衍生物是PPAR-γ的原始配体，这些化合物能够影响机体脂肪的沉积和促进脂肪细胞的分化。来源于草料的不饱和脂肪酸和类胡萝卜素可以增强PPAR-γmRNA的表达［14］。本试验结果显示，在低精粗比日粮组山羊瘤胃中PPAR-γmRNA的表达量显著高于其他两组的，这可能与其草料比例高，以及不饱和脂肪酸和类胡萝卜素等PPAR-γ原始配体高有关。此外，本试验还发现高精粗比日粮能够促进山羊十二指肠中PPAR-γ基因的表达。

乙酰辅酶A羧化酶（ACACA）是机体内脂肪代谢的关键酶，是脂肪酸合成过程中的第一限速酶；该酶能够催化乙酰辅酶A生成肪酸合成酶的催化底物丙二酸单酰辅酶A，再与乙酰辅酶A发生缩合反应生成多不饱和脂肪酸。抑制ACACA可以减少脂肪的生成，防止脂肪在肌肉、心脏和肝脏等组织中的积累［15］。相关研究发现，给禁食小鼠饲喂高能量和高脂肪的食物能明显提高肝脏细胞中ACACA mRNA的表达［16］。因此，在本试验中，中精粗比日粮组山羊肝脏中ACACA mRNA的表达量高于低精粗比日粮组的，可能与其能量高有关；而在高精粗比日粮组山羊肝脏中ACACA mRNA的表达量又有所降低，可能与日粮的能量和蛋白含量过高，从而影响到体内脂肪酸的合成与代谢有关。从本试验结果来看，中精粗比日粮能够降低山羊瘤胃中ACACA基因的表达。

脂肪酸合成酶（FASN）能够将乙酰辅酶A和丙酰辅酶A转化成软脂酸，是脂肪酸再生的限速酶。FASN基因主要在脂肪酸合成率高的组织中表达，如肝脏和脂肪组织。FASN的过度表达会引起体内脂肪沉积［16］。占今舜等［4］研究发现，高精粗比（75∶25）日粮组犊牛肝脏中的FASN mRNA表达量显著高于低精粗比（65∶35）日粮的，而在瘤胃中的FASN mRNA表达量则相反。本试验结果也表明，提高日粮精粗比可能会促进山羊体内脂肪的沉积。

4 结论

低精粗比日粮能够上调山羊瘤胃中ACOX1、CPT1A、PPAR-γ、ACACA和FASN mRNA的表达，降低肝脏中ACACA和FASN mRNA的表达。高精粗比日粮能够上调山羊十二指肠中PPAR-γmRNA和肝脏中FASN mRNA的表达。说明不同日粮精粗比能够通过调控脂肪酸合成和代谢相关基因的表达来影响山羊体内脂肪的沉积。