碱催化双螺杆动态挤压预处理小麦秸秆制备发酵用糖的研究

唐成伦，王松涛，赵恺晨，刘庆国，单军强，陈彦君，朱晨杰*，沈才洪*

（ 1.江苏集萃工业生物技术研究所有限公司,江苏 南京 210032；2.泸州老窖股份有限公司，四川 泸州 646000；3.南京工业大学，江苏 南京 211816）

0 引言

木质纤维素类生物质具有绿色、低碳、清洁、可再生等特点，深入开发木质纤维素类生物质有利于我国碳中和的目标早日实现。但与淀粉类粮食作物不同的是，木质纤维素存在抗降解屏障阻碍其酶解转化利用。预处理作为木质纤维素利用的必要手段，不仅要破坏木质纤维素的致密结构，还要提高利于酶水解碳水化合物的比表面积和孔径。作为木质纤维素类生物质精炼第一步的预处理过程，其成本所占比例是影响下游生产过程的重要因素。目前，科学界与企业界已经开发了诸多预处理技术，如蒸汽爆破、稀酸、高温水热等预处理手段。但这些方法多为批次处理，采用高温高压处理，处理量小且能耗高，成本居高不下。作为机械预处理的螺杆动态挤压技术可以解决以上问题，并以更低的成本进行连续化生产。

螺杆动态挤压技术具有处理量大、剪切力高、保留时间短、物料传质传热效率高以及易于放大等特点，是用于木质纤维素预处理的一种较为理想的可工业放大的生产装备。螺杆动态挤压技术通常可以配合化学催化剂协同处理，因为螺杆具有高效混合能力，采用较少的化学催化剂达到较理想的处理效果，从而降低工业废水的处理量［1］。螺杆机械主要分为单螺杆与双螺杆挤出机，但由于双螺杆挤出技术具有更广泛的应用基础，因此，木质纤维素类生物质预处理更多采用双螺杆挤出技术。而双螺杆机械又分为同向双螺杆与反向双螺杆，da Sliva教授研究发现，反向双螺杆设备存在螺旋磨损大的缺点，不适宜广泛推广应用；而同向双螺杆由于其可以保持较高的转速，因此，具有物料处理量大、剪切力大、混合及传送效率高等优点［1］。本研究采用同向高速双螺杆挤压技术协同碱催化技术，处理了中国资源丰富的小麦秸秆，考察了催化剂用量和挤出后的保温时间，并对碳水化合物保留率、木质素脱除率和预处理后物料的酶解得糖率的影响进行了研究，同时从预处理单位物料的能量输入等角度对不同的预处理方式进行了对比评估。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

小麦秸秆来源于江苏徐州。纤维素酶购于诺维信公司，其酶活力为245 FPU/mL。工业级氢氧化钠。

1.2 实验仪器

秸秆切割机，鼓式水洗机（400型）和气动脱水机（500型）购自山东晨钟股份有限公司，双螺杆挤压揉搓机（TEP80型）购自河北天正筛选制浆设备有限责任公司，秸秆处理量200 kg/h。

1.3 碱催化双螺杆动态挤压预处理

小麦秸秆切成3~5 cm的小段，将切好的秸秆放入鼓式水洗机中清洗，沉淀泥沙。把清洗好的秸秆放入双螺杆挤出机进行机器预热，使反应仓温度提高。待反应仓温度升高后，将配好的不同浓度、不同温度的碱液加入到双螺杆挤出机中进行反应（2段加催化剂，固液比为1∶2）。将挤出的物料装入气动脱水机挤出黑液，加入2倍的水，清洗挤出黑液。合并螺杆与气动脱水机挤出的黑液，浓缩后调酸沉降得到木质素。处理后的秸秆用于结构分析与酶解制糖。

1.4 小麦秸秆的酶水解

取10.0 g小麦秸秆（原生和预处理后）加入到2 L水解釜中，加入去离子水，用硫酸调pH值为4.8后加入15 FPU/g（小麦秸秆）纤维素酶，在50 ℃的恒温下以150 r/min，水解48 h，定时取样，采用HPLC分析糖含量。检测器为视差检测器，色谱柱为Aminex HPX-87H ion exclusion column（300 mm ×7.8 mm；Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，美国），流动相为50 mol/L稀硫酸，在55 ℃下，洗脱速度为0.6 mL/min。

1.5 分析测试方法

1.5.1 小麦秸秆组分分析 小麦秸秆的组分分析参照美国可再生能源实验室（NREL）标准分析方法进行测定［2］。取0.300 g绝干的小麦秸秆（原生和预处理后）加入到250 mL螺口瓶中，加入3 mL质量分数为72%的浓硫酸，将螺口瓶放入恒温水浴摇床中30 ℃保温1 h。反应后迅速加入84 mL蒸馏水将硫酸浓度稀释至4%，放入高压灭菌锅中121 ℃反应1 h。反应结束后，固液分离，清洗残渣，烘干称重后，放入马弗炉中575 ℃煅烧24 h，称重。采用差量法测定酸不溶木质素与灰分的含量。液相一部分通过高效液相色谱进行糖含量测定，一部分采用紫外分光光度计205 nm测量酸溶木质素含量。

1.5.2 小麦秸秆微观结构的表征 对预处理后的样品进行冷冻干燥，可以较好地标尺预处理后样品的原生结构［3］。采用扫描电镜（FEI Quanta 200FEG SEM）对预处理前后小麦秸秆的表面结构进行表征，操作电压5 kV，放大500倍。

采用X-射线衍射仪（Rigku ultima IV， 日本）测定预处理前后小麦秸秆的结晶度变化。将小麦秸秆过筛100目，扫描范围10~40°，扫描速度为5 °/min。计算公式如下［4］：

其中：CrI表示结晶强度；I002表示结晶区衍射强度，2θ=22.5°；Iam表示无定形区衍射强度，2θ=18.7°。

样品的红外光谱（FTIR）采用美国傅里叶红外光谱仪（Thermo Scientific Nicolet 6700）采集。采用溴化钾（KBr）压片法进行采集，取样品与KBr按质量比1∶100均匀混合后研磨制成薄片，图谱采集范围4000~500 cm-1。

1.5.3 分离提取的木质素表征 木质素二维核磁（2D-HSQC）的采集采用德国Bruker 400 MHz核磁共振仪（Advance 400）采集。取90 mg木质素样品溶解于0.5 mL DMSO-d6中。1H和13C 2个维度的谱宽分别为5000 Hz和20000 Hz。1H维度采样点数为1024次，弛豫时间1.5 s，累加64次。13C维 度采样点数为256次。碳氢耦合常数为145［5］。采用MestReNova软件进行数据处理。

2 结果与讨论

2.1 双螺杆挤出机工作原理分析及螺旋结构变化对纤维的影响

机械预处理中的球磨、盘磨等其基本原理都是采用反复压缩/减压作用使纤维壁疲劳进而进行纤维的分离，但在减压过程中释放的能量大多转化为热能，这些热能可以软化纤维，与此同时，当温度超过木质素的玻璃化温度时，反而会使纤维变硬，不利于进一步的利用。与常规的粉碎和磨解预处理不同，双螺杆挤压揉搓预处理过程中利用压缩力和剪切力使生物质按轴向分裂纤维化，这种作用力产生的热量足以软化木质素，而不超过木质素的玻璃化温度，使纤维解离更多地发生在S1~S2层间，而不是胞间层。这对纤维细胞的初生壁和次生壁有极好的破坏作用，更有利于纤维素酶的酶解。

TEP80型双螺杆挤压揉搓机螺杆采用积木组合式结构，可根据工艺要求调整螺杆构型，螺杆由多组正压输送螺旋与多组反压磨解螺旋构成（图1）。由于螺杆采用多级螺旋解离纤维，因此通过调整螺旋的开口间隙可以控制纤维磨解的粗细程度。表1为未进行化学催化的中性双螺杆挤压预处理效果，螺旋组合中随着最小开口径的减小，酶解效果有所提升，主要是因为双螺杆挤压揉搓纤维，使纤维从细胞壁中暴露出来，增大了比表面积（图2）。但随着摩擦力的增大，能耗也有所提高，当螺旋开口减小到6 mm时，酶解效果并没有明显提高，反而单位处理量下降，因此，优选螺旋开口径为8 mm。单纯进行机械挤压预处理纤维素酶解效果改善有限，主要是因为木质素在预处理过程中并没有脱除，其对纤维素酶的无效吸附作用降低了纤维素酶水解纤维的效率［6］。

图1 双螺杆示意图

图2 预处理前后秸秆SEM图

2.2 碱催化双螺杆挤压预处理对秸秆酶解的影响

中性双螺杆挤压虽然能够有效破坏细胞壁初生壁与次生壁的解离纤维，但是由于预处理过程中半纤维素与木质素依然缠绕在纤维表面，影响了纤维素酶与纤维素的有效接触，因此，纤维素的酶解效果并没有大幅提升。碱催化的双螺杆挤压预处理已受到广泛关注，由于螺杆挤压可以有效解离纤维，碱性药液更容易浸入纤维素内部，在挤压纤维过程中摩擦产热也加速了木质素大分子的断裂溶出。

表1 螺旋开口对酶解效果的影响

2.2.1 预处理后样品的组分分析 摩擦产热效应预热后螺杆机箱温度可高达95 ℃以上，为化学催化的预处理提供了充足的热能。由于螺杆的高速运转，物料停留时间较短，因此，需对挤出料进行保温反应。图3为不同碱浓度及保温时间下碱催化双螺杆挤压预处理后小麦秸秆中纤维素、半纤维素和木质素的含量变化图。如图3所示，碱催化双螺杆挤压预处理后纤维素的损失不会超过10%，主要是因为纤维素具有结晶结构，其致密结构降低了纤维素的降解程度［7］。在碱性条件下，纤维素损失的主要原因是其还原性末端发生了剥皮反应［8］，又因为双螺杆挤压揉搓机能够解离纤维，产生的微纤维可能会溶解在浓碱液中，从而导致纤维素部分损失。相对于纤维素，半纤维素结构疏松，分支多、还原型末端多，因此，在碱性条件下，半纤维素更易产生降解［7］。如图3所示，相对于物料挤出后的保留时间，碱浓度对半纤维素降解的影响更大。当碱浓度由0.2 g/g（小麦秸秆）提升到1.0 g/g时，刚挤出的物料中半纤维素的保留率由87.6%下降到66.1%。虽然随着保温反应时间的延长，半纤维素的保留率会降低，但其影响相对较小。因此，为了保留更多碳水化合物，需要选择适宜的碱用量。木质素作为围绕在纤维素周围的物理屏障，其对纤维素酶的无效吸附作用严重影响了纤维素的酶解效率［6］。之前的研究也证明，木质素的脱除率与酶解糖得率存在一定的线性关系，酶解得糖率随着木质素含量的降低而提高［9］。碱法预处理是木质素脱除最有效地方法之一，在碱性条件下，氢氧根离子可以攻击木质素—碳水化合物复合结构（LCC）、皂化木质素与半纤维素之间的酯键，是木质素与碳水化合物之间的分离。并且在碱性条件下，木质素以阴离子形式存在，也利于其分离溶出［10］。同时，由于螺杆挤压可以有效地解离纤维，碱性药液更容易浸入纤维素内部，在挤压纤维过程中摩擦产热也加速了木质素大分子的断裂溶出。因此，如图3所示，在合适的碱用量条件下，碱催化双螺杆挤压预处理可高效地脱除木质素（超过80%）。虽然较高的碱用量可以加速木质素的分离，但后期碱处理压力大，所以采用较低的碱用量，适当延长挤出后的保温反应时间更经济划算。

图3 不同预处理条件下纤维素和半纤维素的保留率及木质素脱除率

2.2.2 预处理后样品的酶解评价 碱催化双螺杆挤压预处理后，小麦秸秆通过纤维素酶水解得到六碳糖与五碳糖的混合糖液可用于下游发酵工业生产生物能源和生物基化学品。图4为不同预处理条件下纤维素与半纤维素酶水解48 h后的转化率。相对于原生小麦秸秆和单纯双螺杆挤压预处理后秸秆的酶解效果，碱催化双螺杆挤压预处理后，纤维素的酶解效果得到显著改善。如图4所示，随着碱用量的提高，纤维素的转化率大幅提高。例如，当碱用量由0.02 g/g干秸秆提高到0.1 g/g时，刚挤出的物料中纤维素的酶解转化率由41.1%提高到了80.3%。TEP80型双螺杆挤出机为高转速挤出机，因此，物料在反应仓中停留的时间较短，进而后续的保温反应可以使化学药液与木质纤维素充分反应。保温反应1 h在不同碱用量条件下，纤维素酶解转化率都明显提高， 特别是当碱用量为0.06 g/g时，保温1 h后纤维素的转化率由66.2%上升到87.7%。纤维素酶解转化率与木质素的脱除率呈正相关，增大碱用量与延长保温时间都有利于木质素的脱除，因此，纤维素的转化率也会相应提高。但是，当保温反应时间延长超过3 h时，木质素的脱除率不会发生太大变化（图3），所以纤维素的转化率也不会有较大提高。

图4 预处理后纤维素与半纤维素的转化率

由于螺杆挤压解离纤维与碱催化脱除木质素的协同作用，刚挤出物料中半纤维素的转化率也随着碱用量的提高而提高。当碱用量低于0.08 g/g时，随着保温反应时间的延长，半纤维素的转化率明显提高；当碱用量大于等于0.08 g/g时，半纤维素的转化率随着保温反应时间的延长不仅没有明显提高反而会下降，这主要是因为与纤维素相比，半纤维素的保留率受碱用量影响更大。因此，即使在较高碱用量条件下，刚挤出物料的半纤维素转化率较高，但随着保温反应的进行，碱用量较低的物料也会达到理想效果。以酶解总糖得率和预处理经济性为评价标准，当碱用量为0.06 g/g、保温反应时间为1 h时，纤维素和半纤维素的水解率分别为87.7%和75.2%，总糖得率能达到83%。

2.3 预处理前后小麦秸秆的表征

扫描电镜（SEM）可以有效提供小麦秸秆处理前后表面的结构信息。如图5所示，碱催化双螺杆挤压预处理可以有效地解离纤维，使纤维变细，但并不能使纤维完全分离成单根纤维，这些结构上的变化主要是一级和少量的二级破碎［11］。但更重要的一点是，双螺杆挤出机可以充当高效的混合器，使化学药液充分渗透到纤维内部，从而改变木质纤维的化学组成及表面结构。因此，如图5所示，原生小麦秸秆的表面结构光滑、致密，结构有序，严重阻碍了纤维素酶与纤维素的接触。而采用0.02 g/g碱催化反应时，纤维表面开始变得粗糙和松动，但其表面依然覆盖了大量木质素。当碱用量提高到0.06 g/g时，纤维素的结构基本暴露出来，并且变得粗糙无规则。因此，碱用量为0.06 g/g时，纤维素能够取得更好的酶解效果。

由于纤维素大分子中存在大量羟基，使得纤维素分子的分子内和分子间存在大量氢键。纤维素的聚集态结构是由结晶区和无定形区交错链接形成的。通过X射线衍射可以测定纤维素的结晶结构，了解碱催化双螺杆挤压预处理过程中秸秆中的纤维素结晶结构的变化。预处理前后小麦秸秆的X射线衍射图如图6所示，纤维素的结晶结构并未发生变化，依然呈现Ⅰ型纤维素结构。当采用较低碱浓度（0.02 g/g）预处理后，小麦秸秆的结晶度（CI）未发生明显变化，由46.6%上升到48.6%；当采用0.06 g/g碱预处理时，秸秆结晶度明显提高到57.9%。通常来讲，植物原料的结晶度受原料化学组成的影响，主要与纤维素的相对含量有关。预处理后秸秆的结晶度提高，可能是与大部分的木质素、部分半纤维素和少量无定型纤维素的分离脱除相关。虽然双螺杆挤压处理可以解离纤维素，但并没有改变纤维素的微晶结构，所以双螺杆挤压处理只能提高纤维素比表面积，并且增强木质素的分离。通过BET测试，对比原生小麦秸秆与0.06 g/g碱催化螺杆挤压预处理后的秸秆发现，比表面积由1.05提高到了1.91 m2/g，孔容由0.0048 增加至0.0082 cm3/g。因此，小麦秸秆表面结构（比表面积、孔体积、孔径分布）的变化，更有利于纤维素酶与纤维素的接触，从而提高酶解得糖率［12-13］。

图5 预处理前后秸秆的电镜照片

图6 预处理前后秸秆XRD和红外图谱

图6为处理前后小麦秸秆的红外表征图。3300 ~3400 cm-1代表纤维素、半纤维素和木质素中羟基（-OH）的吸收峰，2900 cm-1为甲基和亚甲基中的C-H键的吸收峰。图6中1504 cm-1为木质素芳香环骨架的吸收峰，预处理后其强度降低，说明木质素在预处理后的秸秆中含量降低，且随着碱用量的提高使其信号强度减弱。1160 cm-1、1030 cm-1与895 cm-1分别代表纤维素中C-O-C、第一和第二的C-O-H与β-1，4-糖苷键的吸收峰，相对于原生秸秆预处理后秸秆吸收强度的增强，说明纤维素的含量明显上升。红外表征的结果与图5一致。

2.4 提取的木质素的结构表征

如上文所述，获得高质量的木质素，开发其潜在的应用价值已经成为生物能源开发利用的战略支撑点，而且已经受到广泛关注，因此，对木质素物理结构的研究就显得至关重要。由于酶解木质素被誉为最接近天然木质素的工业木质素［14］，因此，本文选取酶解木质素作为对比进行分析。

通过二维核磁（HSQC）对酶解木质素和螺杆抽提碱木质素的结构进行进一步解析。图7和表2为二维核磁的分析图谱及具体的信号坐标。木质素的二维核磁信号通常分为侧链区（δC/δH50~90/2.5~6.0）和芳环区（δC/δH100~150/5.0~ 8.5）。木质素的主要结构单元（G、S、H）和各种结构单元的链接键（β-O-4’、β-5’、α-O-4’等）都可以通过二维核磁进行表征。如图7所示，在木质素的侧链区，甲氧基为主要信号峰（δC/δH55.58/3.75）。β-O-4’结构为木质素的主要连接结构，主要是因为一年生草本植物生长过程中木质素难于生成碳碳键结构。碱催化双螺杆挤压预处理提取的木质素侧链区存在木聚糖的信号，说明预处理脱木质素的过程中会伴随少量半纤维素的降解。

在HSQC的芳环区，愈创木基（G）、紫丁香基（S）和对羟苯基（H）的信号都清晰可见。此外，还存在α位氧化的紫丁香结构（S’）、对香豆酸（pCA）结构和阿魏酸（FA）结构。S结构的C2，6-H2，6相关信 号 出 现 在δC/δH103.67/6.69 ppm，而S’的C2，6-H2，6相关信号却出现在δC/δH104.67/7.31 ppm，但是在酶解木质素中未出现S’结构，可能是因为纤维素酶在酶解过程中会破坏S’结构。G结构单元的C2-H2、C5-H5、C6-H6的相关信号分别出现在δC/δH110.85/6.98、δC/δH115.45/6.77、δC/δH118.76/6.80 ppm。H结 构 的C2，6-H2，6相 关 信 号 出现 在δC/δH127.40/7.21 ppm。但 是，H结 构 的C3，5-H3，5相关信号并不明显，主要是因为与G结构的C5-H5相关信 号重叠［3］。pCA的C2，6-H2，6、C3，5-H3，5分别出现在δC/δH129.94/7.56、δC/δH114.86/6.66 ppm，并且C3，5-H3，5与G结构的信号有部分重叠。通过二维核磁半定量分析发现，螺杆抽提碱木质素中H单元比例明显下降且S/G比例明显增大，说明木质素分离过程中H单元和G单元更易从木质素大分子中断裂。pCA的Cα-Hα、Cβ-Hβ出现在δC/δH144.18/7.51、δC/δH114.07/6.36 ppm。FA的主要结构同样被标定出，C2-H2、C6-H6、Cβ-Hβ分别出现在δC/δH116.40/6.37、δC/δH122.12/7.10、δC/δH116.40/6.37 ppm。通过核磁对木质素结构单元进行定量分析发现，H、pCA和FA单元结构所占比例明显下降，可能是因为碱水解了阿魏酸、香豆酸与木质素之间的酯键，导致了木质素大分子结构上部分H单元结构的损失。从图7还能发现不饱和脂肪酸U的结构信号为δC/δH129.38/5.31 ppm。

图7 酶解木质素和碱木质素二维核磁图

2.5 物料衡算与不同预处理手段能量输入对比

图8为在最优条件下进行预处理实验的物料衡算及与常规预处理方法能量输入对比。采用的预处理条件为：碱催化剂用量为0.06 g/g干小麦秸秆，保温反应时间为1 h。反应后挤出黑液，清洗固渣后再挤出黑液，对固渣进行酶解。合并浓缩黑液，然后喷雾干燥浓缩黑液得到木质素。从1 t小麦秸秆中，能得到342 kg六碳糖和173 kg五碳糖，总糖得率能达到83%，得到的木质素纯度大约为72%。目前，已经有多种预处理方式应用于工业或中式生产并且各有优劣，但是预处理过程中都会涉及能量的输入（电能、热能等）。通过对比机械研磨（球磨、盘磨）［15］、蒸汽爆破［16］、高温水蒸煮［17］、高温碱蒸煮［18］、亚硫酸盐蒸煮—盘磨［19］等预处理手段的吨能量输入，碱催化双螺杆挤压能量输入最低（仅靠电能无需外部热能输入）。因此，碱催化双螺杆挤压对用于木质素纤维素类生物质预处理组分分离有良好的前景技术手段。

表2 木质素13C-1H相关的二维HSQC核磁的谱图信号归属

3 结论

本文通过碱催化双螺杆动态挤压预处理技术进行了中试水平小麦秸秆预处理实验，考察了螺旋组合中最小螺旋开口对解离纤维和酶解制糖的效果。从能耗与得糖率的角度进行了分析和评价，当螺旋最小开口为8 mm时，效果最优。碱性催化剂可以有效提高双螺杆动态挤压预处理后秸秆的酶解效率，因为碱性催化剂可以加速木质素的降解溶出，降低木质素对纤维素酶的无效吸附作用。当碱用量为0.06 g/g干秸秆、保温时间为1 h时，总得糖率最高，超过80%。通过对分离提取的木质素进行结构表征发现，其化学结构保留良好，仅有部分木质素结构中的酯键水解，少量H结构单元与G结构单元降解。主要因为碱催化双螺杆动态挤压预处理秸秆过程中未进行高温加热，碱性降解程度较低，所以这种木质素更易于后期高值化利用。通过对不同预处理方式的能量输入及预处理效果进行对比发现，碱催化双螺杆动态挤压技术预处理木质素纤维素类生物质具有很好的应用前景。

图8 碱催化双螺杆挤压预处理物料衡算与能量输入对比