利用GS9粒型基因分子标记改良水稻粒型的效应研究

陈 春，郭新亚，王 磊，陈卫军

（江苏省农业科学院 宿迁农科所，江苏 宿迁 223700）

0 引言

水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物之一，对保障粮食安全起到至关重要的作用。我国的水稻育种经过水稻矮化育种、杂交水稻育种、超级稻育种3次绿色革命，水稻的单产已达到6892.5 kg/hm2的水平［1］。江苏作为南方的水稻主产区，品种类型丰富，籼、粳稻亚种并存，每年粳稻的种植面积近200万hm2，籼稻的种植面积在30万hm2左右［2］。在过去的相当长一段时间内，我国的水稻育种以追求高产为主要方向，忽视了稻米品质改良和抗性水平的提升。与国外相比，我国的稻米品质研究起步较晚，大体上可以分为以下3个主要阶段：第一阶段是改革开放以前，国外已经开展稻米品质性状的遗传规律和遗传效应研究，同期内我国对稻米品质的研究还停留在简单的外观检测方面，系统的遗传学研究［3］还未起步；第二阶段是改革开放之后到20世纪末，以稻米品质性状的经典遗传学研究为主要研究方向，初步明确了一些品质性状如粒型、垩白、直链淀粉含量等的遗传规律，但是基因克隆与功能等方面［4-5］的研究还未开展；第三阶段是进入21世纪以来，稻米品质性状相关的分子遗传研究进入了快速发展阶段［6］。在2001～2010年间，主要利用分子标记对品质性状进行遗传连锁、关联分析和相关数量性状位点（QTLs）的定位分析研究［7-9］；从2010年至今，稻米品质性状相关的重要基因陆续被定位和克隆，同时功能基因的分子标记辅助选择和基因编辑技术被用于水稻育种研究，一批具有优良性状或者特殊功能的水稻新品种被选育出来，稻米品质的遗传改良研究进入了快速发展阶段［10］。稻米的品质性状直接决定水稻的商品性。稻米加工企业需要出米率高的（加工品质）品种；优质的外观品质往往使稻米具备较高的商品附加值；好吃又健康（具有较高的营养品质和蒸煮食味品质）的稻米更受消费者青睐。与东北粳稻相比，江苏的粳稻具有丰产性好、单产水平高的优点，但同时也存在稻米品质一般、食味性较差的劣势，其中外观品质是造成江苏地区稻米品质一般的主要原因，主要表现为垩白度、垩白粒率较高。随着大众生活水平和消费水平的不断提升，稻米消费已由单纯的“吃饱”转变为“吃好”，人们对优质稻米的需求越来越多［11］。外观品质和食味品质是衡量优质稻米的重要指标。外观品质主要包含粒型、透明度、垩白度等指标；食味品质常常与直链淀粉含量、胶稠度、蛋白质含量、糊化温度等因素相关。粒型与垩白是稻米外观品质的重要构成要素，其中粒型主要指籽粒的长度、宽度、长宽比等，直接决定了稻米的碾磨品质和稻米消费的商品性，同时该性状的遗传主要由核基因控制；垩白是指稻米胚乳中白色不透明部分，其遗传调控较为复杂，受遗传和环境等因素共同影响。一般认为，少垩白或无垩白以及长粒型稻米的商品价值高［12］。

引入粒型调控基因，采取分子标记辅助选择，定向改良籽粒的粒型，是一种行之有效的育种手段。近年来与水稻粒型相关的功能基因的克隆与遗传研究迅速开展，一批具有重要功能性状的基因被发现和利用，如GS3、GW2、GW5、GS5、AGG3和qGL3等［13］。这些粒型调控主效基因在粒长、粒宽、粒厚等方面控制籽粒形状。例如：GS3粒型调控基因，其突变体导致G蛋白的γ亚基功能的缺失，促进细胞伸长，进而产生长粒性状［14］；GW2通过将其底物锚定在蛋白酶体进行降解，负调控细胞分裂，该基因的突变使得本应降解的底物不能被特异性识别，从而促使颖花外壳细胞分裂，增加颖花外壳宽度，因而胚乳变大，最终粒宽增加，粒重和产量水平相应提高［15］。Zhao等［16］利用图位克隆在水稻第9染色体上精细定位到控制粒长的新基因GS9。过表达GS9导致形成圆形籽粒，该基因的功能缺失突变体gs9籽粒细长，但不影响植株的生长发育、粒重及最后产量；这种粒型可以显著减少垩白的产生，从而减少米粒垩白。GS9编码1种没有已知保守功能域的蛋白质，它通过改变细胞分裂来调节籽粒形状。GS9和卵形家族蛋白OsOFP14、OsOFP8之间的相互作用受OsGSK2激酶（1种油菜素类固醇信号通路的关键调节因子）的调节。遗传互补分析结果表明，GS9的功能独立于其他已知籽粒粒型调控基因，例如：GW5和GS3是2个已经报道的可以控制水稻粒型的基因，为了分析它们与GS9之间的调控关系，将NIL-gs9分别和GW5、GS3的NIL杂交，后代在一定程度上表现出更为细长的粒型，表明GS9、GW5和GS3对粒型的调控具有加性效应，但对其他粒型调控基因没有影响，表明GS9是独立于其他粒型决定基因、新发现的1种粒型调控基因。

泗稻17号是由江苏省农业科学院宿迁农科所新育成的水稻品种，于2019年通过了江苏省审定（审定编号：苏审稻20190011）。该品种产量水平高,稳产性较好，生育期适中，综合抗性强，抗倒伏能力好，熟期转色快。目前，泗稻17号已被大面积示范推广，但是由于该品种的外观品质一般，不能满足目前江苏稻米消费市场对优质、高端大米的需求，势必会制约该品种长久的推广应用。本研究利用日本晴背景的NIL-gs9作为供体亲本，以泗稻17号作为受体和轮回亲本，利用分子标记辅助选择的方法，将粒型调控基因GS9定向转入泗稻17号中，以期实现粒型的快速遗传改良，提高泗稻17号的外观品质。

1 材料与方法

1.1 试验材料

日本晴（NIL-gs9），属中长粒型，作为供体亲本。泗稻17号，属椭圆粒型，作为受体亲本和轮回亲本。将这2个亲本材料杂交配组，标记检测GS9/gs9单株，并将其与泗稻17号回交。对每个回交世代进行分子标记检测，筛选含有GS9/gs9的杂合基因型群体，并与轮回亲本回交3次。通过农艺性状调查，选择主要农艺性状与泗稻17号类似的后代材料，进行1次自交，获得BC3F2分离群体。

1.2 单株选择和粒型考察

于2018～2020年在海南三亚南繁基地和江苏泗阳育种基地进行大田种植。改良材料采取单苗栽插，单穗收获；利用图像分析系统，检测籽粒的长度、宽度、长宽比等。在田间筛选主要农艺性状优于或接近泗稻17号的改良材料，主要考察生育期、株高、每穗总粒数、每穗实粒数、千粒重、结实率、稻瘟病抗性等指标。本研究筛选到3株中长粒型、植株健壮、生育期适中、丰产性较好的改良后代，并以此为研究对象分析改良效果。

1.3 分子标记鉴定

采集幼嫩的水稻叶片，采取CTAB法［5］提取DNA，利用合成的Indel标记IN0919对亲本材料进行多态性检测和后代材料的目标基因筛选。IN0919标记序列为IN0919-F（5′-CGTTTAGGCTGGCTGC-3′）和IN0919-R（5′-CAGTTGGTGGTTT CGTAGAG-3′）。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，共循环33次；最后在72 ℃下再延伸5 min。在PCR扩增完毕后，吸取20 μL PCR产物，点样于3%的琼脂糖凝胶，置于装有1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，在100 V稳压下电泳1 h左右，最后在凝胶扫描成像系统下记录结果。

2 结果与分析

2.1 亲本和后代群体间的标记多态性和检测效果

利用GS9基因的功能性标记对供体亲本、受体亲本进行多态性检测，结果（图1）显示：IN0919在供体亲本和受体亲本间存在明显的多态性；在杂交的后代群体中，IN0919的扩增片段呈现出3种带型，即1号供体亲本带型（A）、2号受体亲本带型（C）和3号杂合带型（B），表明利用IN0919功能标记能够有效地筛选符合目标性状的后代材料。

图1 标记IN0919在受体与供体亲本间的多态性

2.2 选育的主要过程和功能标记辅助选择

于2018年夏季在宿迁正季以泗稻17号为母本，与含有gs9基因的日本晴进行杂交配组；同年冬天在海南开展南繁加代；从F1代开始以泗稻17号为轮回亲本，进行连续回交3次。对每一个世代材料开展主要农艺性状的鉴定和筛选，选择剑叶挺举、株高适中（90～100 cm）、生育期适中（145～150 d）、稻瘟病抗性水平较高（达5级以上）、抗倒伏能力强的后代材料。对符合育种目标的后代材料，利用功能标记开展基因型鉴定。在3次回交之后，得到了 BC3F1代材料；筛选主要农艺性状与泗稻17号相近、含有粒型调控基因gs9、中长粒型的后代材料，并进行1次自交；在BC3F2代分离群体中进行农艺性状的筛选和标记检测，选择中长粒型、主要农艺性状良好的单株18株（图2）。

图2 选育系谱图

2.3 F2群体的粒长分离情况

分析NIL-gs9与泗稻17号的F2代分离群体中单株的粒长、粒宽。短粒单株数量与长粒单株数量分别为317和112株，短粒与长粒的比例为2.83∶1，经卡方检测，符合1对基因3∶1的理论分离比。分析分离群体的粒宽变化，粒宽的变化范围为2.3～2.6 mm，无明显规律。表明在回交群体背景下GS9能够表现出单个主效基因的效应，有效地提高后代材料的粒长，但对粒宽无明显的改良效应。

2.4 粒型基因的改良效应

在泗稻17号和NIL-gs9的后代分离群体中（图3），筛选出1个符合育种预期目标且为中长粒型的优良单株SC104。将SC104的籽粒脱粒后随机抽取100粒种子，统计粒长、粒宽和长宽比，其粒长的变化范围为5.45～5.78 mm，平均值为5.61 mm，与轮回亲本泗稻17号（平均粒长5.10 mm）相比平均增长了0.51 mm，增长幅度较大；粒宽的变化范围为2.76～2.84 mm，平均值为2.78 mm，与轮回亲本（平均粒宽2.81 mm）相比无显著变化；籽粒长宽比的变化范围为1.94～2.10，平均值为2.01，与轮回亲本泗稻17号的长宽比（1.80）相比，变化显著，增加幅度很大（图4）。上述结果表明：水稻粒型功能基因GS9能够有效地延长稻米粒长，保持粒宽基本不变，显著提高籽粒的长宽比，达到改良稻米粒型的目的。

图3 标记对BC3F2群体部分单株的基因型检测结果

图4 亲本和改良单株的水稻粒型对比

3 小结与讨论

江苏省作为南方地区最大的粳稻种植区，从2000年开始，在品种选育和新品种审定过程中重视稻米品质改良，目前对外观品质未达到国标3级优质稻谷标准的品种不予以审定，这有力地促进了江苏粳稻品质性状的改良和提升，选育了一批稻米品质达1级的优质稻谷品种。同时在食味品质研究方面更是形成了江苏特色，以“南粳”系列为代表的半糯性品种，以其独特的“香、糯、软、弹”特性，多次在全国优良食味品评中获奖；宿迁农科所选育的“泗稻301”在2019年全国优良食味品评中斩获第1名。但是由于水稻的品质是由多种性状组成的综合性状，与环境存在较为复杂的互作关系，这也导致在稻米性状的改良过程中难以兼顾所有品质性状。例如南粳9108［17］具有优良的食味品质，但是其暗胚乳影响稻米的外观。同时江苏水稻在灌浆结实期常常遭遇高温天气，这也会导致稻米的垩白粒率和垩白度的增加，从而影响外观品质。一般认为稻米的垩白与粒型密切相关，细长籽粒的垩白度和垩白粒率较低。借助分子标记辅助选择的手段，定向改良籽粒的粒型，增加粒长，能够选育出具有优良外观品质的水稻新品种。例如：方珊茹等［18］利用连锁标记进行回交导入和农艺性状选择，将GS3长粒等位基因及其他外观品质性状基因注入目标亲本，获得了粒长、长宽比和粒重均得到改良的株系。张剑霞［19］利用SF28标记将GS3长粒等位基因和Xa23聚合到珍汕97和II-32B中，获得了粒长性状得到改良的株系。因此，通过借助分子标记辅助选择技术定向导入粒型调控基因，从而改变籽粒粒型，提高外观品质，是迅速改良品质的行之有效的方法。

GS9是最新被克隆的控制水稻粒型的主效QTL，具有延长粒长、改良品质、提高粒重的功能。通过分子标记辅助选择和常规育种相结合的方式，将GS9定向导入目标亲本，可显著提高籽粒的粒长和长宽比，从而改良稻米的外观品质，因此该基因极具应用价值。本研究利用最新克隆的粒型主效基因GS9，采用IN0919标记辅助选择技术，对水稻粒型进行了定向改良，延长了粒长，显著增加了籽粒的长宽比，改良单株的粒型为中长粒型，长宽比约为2.0，与常规粳稻籽粒的长宽比（约为1.8）比较，改良效果显著。但是由于GS3供体亲本材料日本晴（NIL-gs9）的剑叶细长披散，穗型松散，因此，后代材料在株型、剑叶夹角、穗型等农艺性状方面与目前主流的选育目标差异较为显著。拟在后续的改良过程中适当降低株高，提高籽粒的结实率，筛选株型更为紧凑的后代材料，以期能够实现生产应用的目的。

4 展望

种子是农业的“芯片”，育种水平和技术的迅速提升，以及特异性种质资源的发掘与利用，为我国种质持续创新提供了有力保障，也为我国的粮食安全和农业可持续发展提供了重要保障。伴随着分子生物学的快速发展，一大批具有重要功能性状的基因被发掘和利用，稻米品质性状的调控网络也日趋清晰。目前分子标记辅助选择与常规育种相结合的方法已成为江苏水稻育种界采取的主要方法。但是常常是针对某一性状开展定向改良，而水稻的一些性状往往属于综合性状，对单一基因的改良往往达不到预期目标。因此，未来应在综合丰富的优势基因遗传效应的基础上，开展分子设计育种，对稻米的品质性状进行精准改良，从而实现外观品质和食味品质的同步提升。