迪庆藏猪ADFP基因第一外显子多态性位点遗传分析
2022-04-25相德才刘韶娜吴国权
相德才，张 斌，刘韶娜，吴国权
（云南省畜牧兽医科学院/云南省种猪性能测定站/云南省种猪质量检验测试中心，云南 昆明 650224）
脂肪分化蛋白基因（Adipose differentiationrelated protein, ADFP）是一种在脂肪细胞中表达的蛋白，在脂肪细胞前体分化成成熟脂肪细胞时被转录激活[1]。ADFP基因位于猪1号染色体q2.3～q2.7区域，包含8个外显子，全长约13 kb[2]。cDNA序列为1 848 bp，编码459个氨基酸[3]。大量研究发现，ADFP基因的遗传变异不仅与背膘厚度和肌内脂肪性状的表型变异有关[4]，还可以作为猪肌内脂肪沉积和大理石纹特征的候选基因[3]。
迪庆藏猪为云南省迪庆藏族自治州特产，以肉质优良而著称，其肌肉鲜红，富有光泽，肉质鲜嫩，味香可口，营养丰富。本研究以迪庆藏猪为研究对象，利用测序技术对ADFP基因部分启动子区域和外显子1进行SNP筛选，并对SNP位点进行遗传分析，为迪庆藏猪机体脂肪沉积和分子育种提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本研究随机挑选124头10月龄迪庆藏猪为试验材料，于2020年1月在迪庆藏族自治州迪庆藏猪保种场，采集其耳组织置于装有75%酒精的离心管中，-20℃保存。利用组织基因组DNA提取试剂盒提取耳组织基因组DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA浓度。
1.2 引物设计
根据GenBank提供的猪ADFP基因序列（NC_010443.5），用Primer Premier 5.0与Oligo 6.0软件设计引物序列1对，引物序列为F：5'-TAAAGAGCAGCAAAACCGCA-3'，R：5'-CACACCAAACAGCCCTACAG-3'，扩增片段长度为926 bp，送英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。
1.3 PCR扩增和测序
PCR扩增体系总体积为25 μL，包含Mix 12.5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各1 μL，基因组DNA模板（约50 ng）2 μL，8.5 μL ddH2O。PCR扩增反应条件为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40个循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，而后送至中美泰和生物技术（北京）有限公司进行测序。
1.4 统计方法
采用GeneStar软件对测序数据进行分析比对，并用Excel对数据进行计算。
2 结果与分析
2.1 PCR扩增结果和测序结果
PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，凝胶成像系统成像，结果见图1。由图1可知，扩增产物特异性较好，片段大小约为926 bp，与预期片段大小一致。
图1 迪庆藏猪ADFP基因目的片段PCR扩增产物
经过GeneStar软件对测序数据进行分析，由图2可知，迪庆藏猪在ADFP基因启动子区域存在2个SNPs，分别为T195C和G202A；外显子1上存在6个SNPs，分别为G225A、C227G、C279G、C386G、C396T和G504A。
图2 ADFP基因目的片段测序结果比对
2.2 基因频率、基因型频率和遗传特性分析
对各SNPs进行了基因频率、基因型频率、多态信息含量、纯合度、杂合度计算（表1）。结果显示，各位点在迪庆藏猪猪群中均处于Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。群体遗传分析显示，本研究发现的SNPs多态信息含量处于低度多态，C396T位点最高为0.188 9，T195C、G202A和G225A位点最低，均为0.038 4；杂合度均小于0.5，C396T位点最高为0.211 2，T195C、G202A和G225A位点最低，均为0.039 2。
表1 不同SNPs位点基因频率、基因型频率、多态信息含量、纯合度、杂合度
由表2可知，SNP4与SNP5之间D'值接近0，说明两位点间连锁平衡的可能性很小，其余大部分SNP位点之间D'值接近1，说明这些位点间发生重组的可能性很小；而D'值接近中间值的则无法比较两位点连锁平衡的差别。
表2 各SNPs之间连锁分析（D'值）
单倍型分析结果表3，常见单倍型有6种，累计频率为0.972 1，其中单倍型1的频率为0.724 2，单倍型2的频率为0.069 2，单倍型3的频率为0.053 4。
表3 8个SNPs组成的单体型分析结果
3 讨论
顾丽菊等[5]在两个地方猪种ADFP基因中筛查到5个SNPs，分别为T37C、T140C、G777A、A1061G和A1117G。本研究共在ADFP基因启动子区域和外显子1上发现8个SNPs，其中G225A位点引起了氨基酸突变；甘氨酸突变为丝氨酸，C386G位点引起了氨基酸突变，谷氨酰胺突变为谷氨酸；其余位点为无义突变。
ADFP基因可作为研究脂肪沉积的候选基因，主要参与脂肪细胞的生成、转移、代谢和储存等过程，对调节机体的脂肪沉积过程有着相当重要的作用[6]。经过Hardy-Weinberg平衡检验，各SNPs均处于平衡，说明人工选择压较小，有利于发展下一步的遗传育种工作。本研究发现所有的SNPs多态信息含量（PIC）和杂合度（He）均小于0.5，说明群体内基因型遗传变异较小，选择潜力也比较小，为下一步研究ADFP基因SNPs的基因型对脂肪沉积的调控提供重要依据，也为下一步开展遗传育种工作提供了理论基础。
