泥膜混合MBBR系统自养脱氮工艺的启动研究

姚丽婷，陈启智，赖勇州，梁瑜海,2*

1. 华南农业大学资源环境学院，广东 广州 510642

2. 华南农业大学，广东省农业农村污染治理与环境安全重点实验室，广东 广州 510642

自养脱氮工艺包括短程硝化和厌氧氨氧化过程，它通过好氧氨氧化细菌(ammonium oxidizing bacteria,AOB)的作用，将部分氨氮氧化成亚硝酸盐氮，再通过厌氧氨氧化菌(anaerobic ammonium oxidizing bacteria,AnAOB)的作用，将剩余的氨氮和亚硝酸盐氮转化成氮气. 与传统的硝化反硝化工艺相比，自养脱氮工艺可节省大量曝气能耗，不需外加有机碳源，脱氮效率高，且污泥产量低，具有非常广阔的应用前景.但是AnAOB增倍时间长达11 d，生长缓慢，且易流失，难以富集，导致工艺启动时间长.

为解决此类问题，自养脱氮工艺多采用生物膜法形式，且移动床生物膜反应器(moving bed biofilm reactor, MBBR)是较为理想的选择之一. MBBR的悬浮填料作为生物膜的载体，AOB先在外层好氧区利用溶解氧(DO)把氨氮转化成亚硝酸盐氮，为AnAOB提供缺氧环境；在内层缺氧区，AnAOB利用亚硝酸盐氮和氨氮转化成氮气和少量硝酸盐氮，由此完成脱氮. MBBR系统主要有两种，分别为泥膜混合MBBR系统和纯膜MBBR系统. 其中，纯膜MBBR系统只有悬浮填料，没有悬浮态污泥；而泥膜混合MBBR系统结合了活性污泥法和生物膜法的优点，得到了广泛的应用. 采用泥膜混合MBBR系统可强化自养脱氮微生物的富集过程，以期减少自养脱氮工艺启动时间.

目前，MBBR自养脱氮的启动研究中，接种污泥多是来自稳定运行的一体式自养脱氮反应器(completely autotrophic nitrogen removal over nitrite, CANON). 如吕恺等通过接种CANON的生物膜(填充率为25%)，构建序批式泥膜混合MBBR系统，在DO浓度为0.4～0.7 mg/L的条件下，经过115 d成功启动CANON工艺并稳定运行；周家中等通过动态流接种CANON污泥，在泥膜混合MBBR系统中，经过70 d成功启动CANON工艺. 这些研究中接种的CANON污泥都较难获得. 笔者在序批式短程硝化絮状污泥反应器中，投加含有少量AnAOB的悬浮填料，构建泥膜混合MBBR系统，尝试启动自养脱氮工艺，并对启动前后的絮状污泥样品和填料生物膜样品进行高通量测序，分析该系统中不同时期絮状污泥和填料生物膜的微生物特征，以期为自养脱氮工艺的启动及宏观调控提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验装置及工艺流程

如图1所示，MBBR有效体积为20 L，由圆柱形的塑料桶、曝气装置、搅拌器和抽水泵组成. 接种短程硝化絮状污泥，投加无明显厌氧氨氧化活性的悬浮填料(含有少量AnAOB)，填充率为20%. 该试验运行93 d，进水为人工配水. 根据水质情况分为两个阶段：阶段Ⅰ为第1～56天，进水中含有200 mg/L的NH-N和100 mg/L的NO-N；阶段Ⅱ为第57～93天，进水只有200 mg/L的NH-N. 每个阶段都添加NaHCO，提供碱度和无机碳源.

图 1 MBBR装置示意Fig.1 Schematic diagram of the MBBR

MBBR以序批式模式运行，51 d前，其运行周期包括进水、反应、沉淀、排水、闲置5个阶段，其中反应阶段包括曝气和搅拌，搅拌结束后采集水样作为出水. 第51天后，探讨了缺氧时间对厌氧氨氧化反应的影响，增加静置阶段，静置结束后采集水样作为出水，其运行周期包括进水、反应、沉淀、排水4个阶段，一个周期为24 h，其中反应阶段包括曝气+搅拌、缺氧搅拌和静置，具体情况如表1所示. 试验在室温(20～30 ℃)下运行，进水pH为7.8～8.2，DO浓度为0.2～0.9 mg/L.

1.2 分析测试方法和计算方法

NH-N、NO-N、NO-N浓度均采用UV-1800型紫外/可见光分光光度计 (上海美谱达仪器有限公司)测定，其中NH-N浓度用纳氏试剂分光光度法测定，NO-N浓度用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定，NO-N浓度用紫外分光光度法测定，pH和DO浓度采用Multi3630便携式多参数测定仪(德国WTW公司)测定. 氨氧化率(ammonia oxidation rate,AOR)、亚硝酸盐氮积累率(nitrite accumulation rate,NAR)和TN去除率(nitrogen removal rate, NRR)分别按照式(1)～(3)计算.

表 1 自养脱氮工艺运行情况Table 1 Operation of the autotrophic nitrogen removal process

式中：(NH-N)、(NH-N)分别为进、出水的NH-N质量浓度，mg/L；(NO-N)、(NO-N)分别为进、出水的NO-N质量浓度，mg/L；(NO-N)、(NO-N)分别为进、出水的NO-N质量浓度，mg/L；(TN)、(TN)分别为进、出水的TN质量浓度，mg/L.

1.3 污泥的微生物特征分析

在运行的第1天和第93天，从MBBR中获取污泥样品. 将污泥样品置于50 mL无菌塑料试管中，并于-20 °C保存，后送至生工生物工程(上海)股份有限公司，进行DNA提取和高通量测序. 测序区域为细菌16S rRNA的V3～V4区域，PCR扩增引物采用341F/805R(341F为CCTACGGNGGCWGCAG，805R为GACTA CHVGGTATCTAATCC). 所得序列用uclust(uclustv1.1.579)进行聚类分析，将相似度97%定义为操 作 分 类 单元(operational taxonomic unit，OTU). 用Mothur(http://www.mothur.org)计算Shannon-weiner指数，采用Silva(http://www.arb-silva.de)进行比对.

2 结果与讨论

2.1 MBBR运行性能分析

阶段Ⅰ中，第1～44天的短程硝化过程稳定，平均AOR为57.88%，且NAR稳定在97%以上. 这可能是因为进水游离氨(free ammonia, FA)浓度(15～25) mg/L较高，有效地抑制了亚硝酸盐氧化菌(nitrite oxidation bacteria, NOB)的活性. 由于运行初期AOR较高，导致MBBR中NH-N和NO-N的比例失衡，第28～56天的曝气时间减至1.75 h.

由图2(a)(c)(d)可知，第45天，AOR和NRR分别增至71.31%和26.83%，同时有8.48 mg/L的NO-N产生. 第45～56天，NO-N浓度变化值与TN损失的比值(ΔNO-N/ΔTN)平均为0.113，与式(4)计算的理论值(0.125)较为接近. 这表明MBBR中发生了厌氧氨氧化反应. 而ΔNO-N/ΔTN低于理论值，说明厌氧氨氧化反应生成的部分NO-N被内源反硝化消耗.

阶段Ⅱ的进水不再额外投加NO-N，厌氧氨氧化反应所需的NO-N由短程硝化提供. 第57～68天的厌氧氨氧化作用大幅提高，平均NRR提高至61.99%.其中在第57～59、66、69天分别测定了进水、曝气阶段结束出水、反应阶段结束出水的3种氮素浓度，得出曝气阶段(从进水到曝气阶段结束)和缺氧阶段(从曝气阶段结束到反应阶段结束)的氮素浓度变化值. 以ΔNH-N、ΔNO-N、ΔNO-N分别表示每个阶段NH-N、NO-N和NO-N的浓度变化. 由表2可知，第57～59、66、69天曝气阶段ΔNH-N和ΔTN的平均值分别为114.44、23.91 mg/L，说明曝气阶段主要发生短程硝化反应、少量的厌氧氨氧化和内源反硝化反应. 对于静置缺氧阶段，ΔTN的平均值为103.08 mg/L，而ΔNH-N:ΔNO

图 2 运行期间NH4+-N浓度、NO2--N浓度、NO3--N浓度、TN浓度、AOR、NAR和NRR的变化Fig.2 Changes of NH4+-N concentration, NO2--N concentration, NO3--N concentration, TN concentration, AOR, NAR and NRR during operation

-N:ΔNO-N的平均值为1:1.43:0.25，接近厌氧氨氧化的理论比值(1:1.32:0.26)，说明缺氧阶段主要发生厌氧氨氧化反应和少量内源反硝化反应. 而曝气阶段只有少量厌氧氨氧化反应，这主要是生物膜厚度还不够，氧气能通过外侧的好氧层，抑制厌氧氨氧化反应.

表 2 第57～59、66、69天氮素平均浓度的变化Table 2 The change values of nitrogen on days 57th to 59th,66th and 69th

因此，第69～93天进一步调整运行模式，曝气量从25.0 L/min逐步减至8.3 L/min，DO浓度降至0.4 mg/L左右，曝气时间从1.75 h逐步增至3.75 h，促进AOB和AnAOB在曝气阶段同时反应. 维持AOR在50%左右，继续在缺氧阶段为AnAOB提供适宜比例的基质. 该阶段自养脱氮效果逐渐提高，平均NRR从60%逐渐提高至70%.

在泥膜混合MBBR系统中，接种的短程硝化絮状污泥既能保证短程硝化的稳定进行，又为AnAOB的富集提供了基质与保护作用. 在第45～93天，自养脱氮工艺稳定运行，曝气阶段主要进行短程硝化，厌氧氨氧化反应主要发生在缺氧阶段，平均NRR达到62.24%.

2.2 泥膜混合MBBR系统中微生物的特征

微生物多样性

在微生物特征分析中共有4个样品，Rs0为初始絮状污泥、Rs1为第93天絮状污泥、Rb0为初始接种填料生物膜、Rb1为第93天填料生物膜. 如图3所示，Rs0、Rs1、Rb0、Rb1的OTU数量分别为504、594、562、620. 运行后期絮状污泥和生物膜样品的OTU数量增加，说明泥膜混合MBBR系统在启动自养脱氮工艺的过程中，促进了微生物富集，使得该系统中微生物的种类数量提升.

图 3 样品的OTU分布Venn图Fig.3 Venn diagram of OTU distribution of samples

图 4 样品中微生物的Shannon-Weiner指数曲线Fig.4 Curve of Shannon-Weiner index of microorganisms in sample

由图4可 知 ，Rs0、Rs1、Rb0、Rb1的Shannon-Weiner指数分别为2.73、3.51、2.51、3.21. 运行后期，泥膜的Shannon-Weiner指数较大，说明采用泥膜混合MBBR系统可提高MBBR内的生物多样性，这与OTU分析结果符合. 但是对比同时期絮状污泥和填料生物膜Shannon-Weiner指数的大小(Rs0＞Rb0, Rs1＞Rb1)，发现其与OTU分析结果(Rs0＜Rb0, Rs1＜Rb1)正好相反. 这种差异是由于样品中微生物种群的均匀程度不同造成的. Shannon-Weiner指数是综合考虑物种种类数量和均匀度的指标. 填料生物膜的外层和内侧存在环境差别，分别生长着不同的微生物，最终显示出较高的不均匀性，所以综合计算时填料生物膜的Shannon-Weiner指数较小.

微生物群落结构分析

从门分类水平对微生物特征进行分析，由图5(a)可知，Rs0、Rs1、Rb0、Rb1中Bacteroidetes(拟杆菌门)、Proteobacteria(变形菌门)、Planctomycetes(浮霉菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门)的相对丰度均较大. 拟杆菌门是化能有机营养菌，可以降解多种复杂有机物，广泛存在于活性污泥系统中. 由于该试验不投加有机碳源，MBBR运行后期，填料生物膜的拟杆菌门相对丰度由64.75%降至32.35%. 变形菌门是污水处理系统中活性污泥的重要组成部分，与生物硝化作用和有机物降解有关. 大多数与脱氮相关的功能菌都属于变形菌门. 浮霉菌门是AnAOB所在的菌门，Rs0、Rb0、Rs1、Rb1中浮霉菌门相对丰度分别为0.96%、13.06%、9.56%、30.77%，运行后期浮霉菌门的相对丰度都有所增加，其中填料生物膜中浮霉菌门的相对丰度增幅较大. 绿弯菌门是厌氧氨氧化系统中常见的菌门，绿弯菌门可分解死亡的AnAOB，且它的丝状结构有利于生物膜的形成. Rs0、Rb0、Rs1、Rb1中绿弯菌门相对丰度分别为2.73%、2.45%、4.03%、7.04%，运行后期绿弯菌门相对丰度有所增加，且填料生物膜中绿弯菌门的相对丰度较大，可见绿弯菌门对于厌氧氨氧化和生物膜系统具有重要作用.

图5(b)为属水平的微生物特征，Rs0、Rb0、Rs1、Rb1中AOB的优势菌属均为，相对丰度分别为42.95%、6.85%、30.98%、3.97%. 运行后期的相对丰度都有所减少，这是因为是r-对策者，底物亲和力较低，适合在高浓度DO条件下生长. 而启动过程中控制DO浓度，导致的相对丰度降低. 已有研究表明，AOB在填料上生态位的竞争中处于劣势. 运行后期，絮状污泥中的相对丰度比填料生物膜中较高，说明AOB主要分布在絮状污泥中，这是由于氧气在絮状污泥中的传质阻力小于生物膜.另外，泥膜混合MBBR系统中还检测出一种兼性好氧异养菌，该菌可以利用NH-N进行异养硝化反应. Rs0、Rb0、Rs1、Rb1中的相对丰度分别为0.27%、2.75%、1.00%、2.40%. 运行过程中，的相对丰度变化不大，说明泥膜混合MBBR系统中短程硝化可能是由AOB和异养硝化细菌合作完成的. 泥膜混合MBBR系统中唯一检出的NOB菌属是，的相对丰度在所有污泥样品中都小于0.05%，说明了NOB被有效地抑制.

图 5 不同阶段门水平和属水平上微生物的相对丰度Fig.5 Relative abundance of microorganisms at Phylum level and Genus level with different stages

泥膜混合MBBR系统中检出的AnAOB菌属总共有3种，分别为、、，其 中的相对丰度在所有样品中都很小，在0.005%左右. 在絮状污泥中，初始时和的相对丰度为0.01%和0%，运行后期相对丰度分别增至4.72%和0.12%. 这说明接种的短程硝化絮状污泥中几乎没有AnAOB，在自养脱氮工艺成功启动后，絮状污泥中含有少量的，而变化不大. 在填料生物膜中，初始时和的相对丰度分别为4.05%和1.82%，运行后期相对丰度分别为25.75%和0.14%. 这表明在接种填料生物膜上存在少量的AnAOB，随着反应的进行，_的相对丰度大大升高，成为泥膜混合MBBR系统中AnAOB的优势菌属，而的相对丰度远低于前者. 有研究表明，在特定环境条件下启动成功的自养脱氮系统内只有一种AnAOB会成为优势菌属，这与该研究的结果类似. 此外，运行后期的填料生物膜中，AnAOB的相对丰度较高，说明AnAOB主要分布在填料生物膜中.

泥膜混合MBBR系统中还检出、、、、、、等反硝化菌属. 其中，都属于好氧反硝化菌，已有研究表明，能够与AnAOB共生，保护AnAOB免受氧气和有机物的抑制. 运行后期，填料生物膜中的相对丰度由54.57%降至23.89%，该菌含有氧化一氮和一氧化二氮还原酶的基因，可进行反硝化反应.运行后期，填料生物膜中反硝化菌的相对丰度较高，说明泥膜混合MBBR系统中部分TN损失是由内源反硝化贡献的.

综上，自养脱氮工艺成功启动后，泥膜混合MBBR系统中絮状污泥和填料生物膜中均存在AOB和AnAOB，但两类菌群分布规律并不相同，主要分布在絮状污泥中，而则主要分布在填料生物膜中. 这说明在泥膜混合MBBR系统中絮状污泥和填料生物膜各司其职，分别完成短程硝化和厌氧氨氧化反应.

3 结论

a) 在短程硝化絮状污泥反应器中投加悬浮填料，构建泥膜混合MBBR系统，在温度为20～30 ℃、进水pH为7.8～8.2、DO浓度为0.2～0.9 mg/L的条件下，经过45 d，成功富集了AnAOB，成功启动厌氧氨氧化反应. 曝气阶段主要发生短程硝化，曝气结束后的缺氧阶段主要发生厌氧氨氧化和少量内源反硝化反应，平均NRR达到62.24%.

b) 泥膜混合MBBR系统中，AOB主要分布于絮状污泥中，而AnAOB主要分布于填料生物膜中. AOB的优势菌属为，AnAOB的优势菌属为.

c) 运行后期的填料生物膜中存在反硝化细菌，泥膜混合MBBR系统中部分TN损失是由内源反硝化贡献的.