NEFL通过激活EGFR/AKT/S6信号通路促进食管鳞癌细胞的侵袭迁移

范志露，杨荔艳，张娜，冯丹，郭静，常晨，苑青，蔡岩，张钰，魏文强，王明荣，郝佳洁

NEFL通过激活EGFR/AKT/S6信号通路促进食管鳞癌细胞的侵袭迁移

范志露1，杨荔艳2，张娜1，冯丹1，郭静1，常晨1，苑青1，蔡岩1，张钰1，魏文强3，王明荣1，郝佳洁1

1. 国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心，中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院，分子肿瘤学国家重点实验室，北京 100021 2. 国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心，中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院检验科，北京 100021 3. 国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心，中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院流行病学中心，北京 100021

为探讨神经丝轻链(neurofilament light chain, NEFL)在食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)中的表达情况及作用机制，本研究首先对食管鳞癌组织及配对的正常食管上皮中的mRNA和蛋白表达情况进行了检测。基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus, GEO) RNA表达数据，以及临床标本的实时荧光定量逆转录–聚合酶链式反应(real-time quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR)分析结果显示，与正常食管上皮组织相比，食管鳞癌组织中基因mRNA水平明显升高。Western blot分析结果显示，与正常食管上皮组织相比，食管鳞癌组织中NEFL蛋白水平也明显升高。进一步采用CCK8法和Transwell法检测NEFL过表达对食管鳞癌细胞恶性表型的影响，结果显示敲降后，食管鳞癌细胞的侵袭和迁移能力显著减弱。体内裸鼠成瘤实验显示，敲降可显著抑制肿瘤生长。分子水平检测表明，敲降显著升高上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关分子E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达并降低N-钙黏蛋白(N-cadherin)的表达、下游分子表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)的mRNA和蛋白的表达水平，蛋白激酶B (protein kinase B, PKB；又被称为AKT)和核糖体蛋白S6 (ribosomal protein S6)的磷酸化水平也显著降低。敲降后转染EGFR过表达载体，AKT和S6的磷酸化水平以及食管鳞癌细胞侵袭和迁移表型都得以恢复。以上研究结果表明，NEFL过表达可能通过激活EGFR/AKT/S6信号通路促进食管鳞癌细胞EMT，最终促进食管鳞癌细胞的侵袭迁移。

NEFL；食管鳞癌；侵袭迁移；EGFR；上皮间质转化

食管鳞癌是中国常见的消化道恶性肿瘤之一[1,2]。在食管鳞癌早期，绝大多数患者没有出现明显症状，且一部分患者在早期就发生了局部浸润和远端转移。晚期食管鳞癌患者的治疗效果和预后不佳，导致食管鳞癌患者的五年生存率较低[3]。因此，迫切需要深入研究食管鳞癌细胞恶性行为的分子机制，发现具有临床应用前景的治疗靶点，以提高食管鳞癌患者的生存率。

基因定位于染色体8p21，编码蛋白的分子量为68 kDa。NEFL是神经元骨架蛋白之一，其作为神经丝的重要组成成分，对维持神经元的完整性至关重要[4]。研究表明，NEFL可以维持神经细胞形态，并调节细胞内神经递质向轴突和树突的转运过程[5]。研究报道，NEFL除了在神经元疾病中发挥明确作用外，NEFL在胃癌和乳腺癌组织中表达升高[6,7]。然而，与正常组织相比，神经胶质母细胞瘤中的NEFL表达降低[8]。此外，NEFL高表达与乳 腺癌、神经母细胞瘤和非小细胞肺癌的良好预后相关[7,9,10]。上述结果表明，NEFL在实体瘤中的作用和功能需要进一步阐明。本研究检测了基因在食管鳞癌组织和细胞系中的表达情况，并分析了其异常表达对食管鳞癌细胞生物学表型的影响，为阐明在食管鳞癌中的意义提供了实验证据。

1 材料与方法

1.1 食管鳞癌临床样本

27例食管鳞癌组织及配对的正常食管上皮组织于2011～2012年取自河南省林州市食管癌医院。所有患者手术前未接受过任何治疗，所有标本均为病理诊断后的剩余标本。本研究已获得中国医学科学院肿瘤医院伦理委员会的批准(No. 16-171/1250)，所有患者均已签署书面知情同意书。

1.2 细胞培养

食管鳞癌细胞系KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE150、KYSE180、KYSE450和KYSE510细胞为日本东京大学Shimada教授惠赠，TE1细胞购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection, ATCC)公司，均使用含10%胎牛血清(NEWZERUM)的RPMI 1640培养基(北京细工生物公司)，置于37℃含5% CO2的培养箱中培养。人胚肾细胞293FT (美国Invitrogen公司)使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基(北京细工生物公司)，添加1% L型谷氨酰胺、1%非必需氨基酸以及1% Geneticin (美国Gibco公司)，置于37℃含5%CO2的培养箱中培养。

1.3 过表达载体构建

利用RNA纯化试剂盒(北京康为世纪公司)从食管鳞癌细胞中提取RNA，使用逆转录试剂盒(北京康为世纪公司)获得cDNA，以该cDNA为模板进行PCR获得和基因编码区全长。使用真核表达载体pcDNA3.1(+)/Myc-His C构建瞬时过表达载体。用于构建基因瞬时过表达载体的引物序列：上游：5′-CCAAGCTTATGAGTTCCTTC­AGCTA­CGA-3′，下游：5′-CGGAATTCGATCTTT­CTTCTTA­GCTGCTTG-3′；用于构建基因瞬时过表达载体的引物序列：上游：5′-GGTACC­ATGCGACCCTC­CGGG-3′，下游：5′-CTCGAGCT­GCTCCAATAAA­TTCACTGCT-3′。

1.4 慢病毒包装和靶细胞感染

慢病毒干扰载体pLKO.1 puro以及慢病毒包装质粒psPAX2和pMD2G均为本实验室保存质粒载体。取对数生长期的293FT细胞接种于6 cm细胞培养皿中，37℃培养12 h，待细胞汇合度为80%时进行转染，加入含18 μL Lipofectamine 2000 (美国Invitrogen公司)、6 μg pLKO.1、3 μg psPAX2、3 μg pMD2G的Opti-MEM溶液(美国Gibco公司)，6 h后更换成2.5 mL含30%胎牛血清的完全培养基培养，24 h和48 h后各收集一次上清，用0.45 μm滤膜过滤，保存于–80℃冰箱。感染靶细胞时，将0.5 mL病毒上清和1.5 mL完全培养基加入到含密度为30%～50%的靶细胞的六孔板中，并加入8 mg/mL poly­brene，培养24 h后更换为完全培养基，利用2 μg/mL嘌呤霉素进行筛选。干扰NEFL表达的慢病毒shRNA (shNEFL)序列：上游5ʹ-CCGGGCACGCTCAGCTT­ACTCAACTCGAGTTGAGTAAGCTGAGCGTGCTT­TTTG-3ʹ，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.5 siRNA/质粒转染

取对数生长期细胞接种至六孔板中，37℃培养12 h，待密度为30%～50%时进行siRNA转染(待密度约为80%时进行质粒转染)，每孔细胞采用A：5 µL siRNA (2 μg质粒)+250 µL Opti-MEM；B：5 µL Lipofectamine 2000+250 µL Opti-MEM，A和B先单独孵育5 min，后混合孵育20 min。在上述混合孵育20 min期间，可以将上述要转染的六孔板换成RPMI 1640培养基。37℃培养6 h后更换为完全培养基继续培养，48 h后收集细胞进行后续实验。瞬时敲降基因的siRNA序列为：5ʹ- GUCCUACUACA­CCAGCCAUTT-3ʹ (siNEFL-1)和5ʹ- GCACGCUCAG­CUUACUCAATT-3ʹ (siNEFL-2)，由苏州吉玛基因股份有限公司合成。

1.6 总RNA提取和实时定量qRT-PCR

采用组织&细胞RNA纯化试剂盒(北京康为世纪公司)提取纯化总RNA。将得到的RNA作为模板，使用HiFiScript cDNA合成试剂盒(北京康为世纪公司)逆转录合成cDNA。使用TB Green®Premix Ex TaqTM试剂盒(日本TaKaRa公司)及ABI Quant­Studio 5进行实时定量qRT-PCR实验。以基因mRNA表达水平为参照，进行归一化处理，获得靶基因的相对mRNA表达水平。本实验中使用的引物序列如下：正向引物：5′-CCAGAGCTC­CCAGGTCTTTG-3′，反向引物：5′-TAGTA­GGACGGGAAGGAGCG-3′；正向引物：5′- GCAGAGACCCACACTACCAG-3′，反向引物：5′-TGTGCTGTTGACACAGGTGG-3′；正向引物：5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGA-3，反向引物：5′-CATACCAGGAAATGAGCTT­GACAA-3′。

1.7 蛋白提取和Western blot实验

培养细胞至对数生长期时收获(对于转染后的细胞，则于转染48 h后收获)，用细胞刮刮取细胞于收集管中，1000 r/min离心5 min，弃上清获得细胞沉淀。加入适量蛋白裂解液(上海碧云天公司)，冰上裂解30 min，12000 r/min，4℃离心15 min，取上清移至新的离心管中。临床标本蛋白采用组织蛋白提取试剂盒提取(美国Invent Biotechnologies公司)。使用BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)进行蛋白定量。取一定体积的蛋白样品，加入5×上样缓冲液，98℃金属浴中变性10 min，瞬时离心。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳90 min，使用湿转电转仪将蛋白从分离胶转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)，用5%脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗后4℃孵育过夜。一抗包括：购自美国Cell Signaling Technology公司的E-cadherin、磷酸化EGFR、磷酸化AKT、AKT、磷酸化S6、S6抗体，购自美国Proteintech公司的N-cadherin、EGFR、GAPDH、His标签抗体，购自美国ABclonal公司的NEFL。使用洗涤缓冲液TBST清洗4次，每次6 min，加入相应二抗，室温孵育1 h，TBST清洗4次，每次6 min，使用Amersham Imager 800成像仪进行曝光。

1.8 细胞增殖实验

收集细胞并进行计数，KYSE70和KYSE140分别取1000个和2000个细胞，接种于96孔板中，亲本组、NC组和基因敲降组均设置4个平行孔和空白对照孔，于37℃、CO2体积分数为5%培养箱中培养12 h后开始，每天同一时间取出一块96孔板进行检测。每孔加入100 µL CCK8稀释液(购自日本同仁化学；使用RPMI 1640按1∶10比例稀释)，于37℃培养箱中培养1 h。使用酶标仪(美国BioTek公司)在450 nm处测量吸光度值，计算相对生长速率，绘制细胞生长曲线。

1.9 细胞侵袭和迁移实验

使用直径6.5 mm，孔径8 μm的Transwell检测细胞侵袭和迁移能力。对于迁移实验，预先在小室中加入100 μL不含血清的培养基水化2 h，细胞转染24 h后，消化收集目的细胞，用不含血清的RPMI 1640培养基悬浮并计数。在Transwell下室加入750 μL含30%血清的RPMI 1640培养基，上室加入200 μL含1～2×105个细胞的悬液，将Transwell板置于CO2培养箱中培养(KYSE70培养60 h，KYSE140培养48 h)，取出小室，用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline, PBS)清洗1次，用固定液(甲醇∶丙酮=1∶1)固定1 h，再用0.5%结晶紫染色30 min，用流水冲洗小室，并小心擦拭掉上层细胞，用中性树胶进行封片，于镜下拍照计数。对于侵袭实验，预先在小室中加入50 μL稀释好的Matrigel基质胶，置于CO2培养箱中，37℃孵育2 h，其余操作同迁移实验。

1.10 裸鼠移植瘤实验

无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级4周龄雌性BALB/cA-nu裸鼠(北京华阜康生物科技股份有限公司)，实验前称量体重，按照体重分组，使不同体重的裸鼠在各组间平均分布。将生长状态良好的对数生长期细胞消化，PBS清洗两遍，重悬于PBS中计数，将含3×106个/100 μL浓度的细胞接种于裸鼠上肢腋下部位。待瘤体长出后每周测量2次皮下瘤体积。计算公式为：体积=长径×短径×短径×0.52。3周后处死裸鼠，解剖并称量瘤体体积和质量。

1.11 统计学分析

使用GraphPad Prism8.0软件对数据进行统计学分析，检验用于评估实验组和对照组之间的差异，< 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 NEFL在食管鳞癌组织中高表达

本研究利用GEO数据集GSE23400分析了食管鳞癌中基因mRNA的表达情况。结果表明，与正常组织相比，基因mRNA在食管鳞癌中表达明显升高(= 53，< 0.0001) (图1A)。进一步检测了27例食管鳞癌及配对的正常食管上皮组织中基因mRNA和蛋白水平，结果显示，与正常组织相比，27例肿瘤组织的基因mRNA水平(图1B)和蛋白水平(图1，C和D)显著上调，结果有统计学意义。

2.2 NEFL在食管鳞癌细胞中高表达

使用癌细胞系百科全书(Cancer Cell Lines Ency­clopedia, CCLE)数据库中的基因表达数据集分析了来自不同癌症类型的细胞系中基因mRNA的表达水平，结果表明，在食管鳞癌细胞系中高表达。与其他肿瘤细胞系相比，食管鳞癌细胞系中基因mRNA表达的平均值排名第5 (图2A)，中位值排名第7 (图2B)。随后，进一步分析了NEFL蛋白在8个食管鳞癌细胞系中的表达情况，结果显示NEFL蛋白在KYSE70和KYSE140细胞中高表达，而在KYSE30、KYSE150、KYSE180、KYSE450、KYSE510和TE1细胞中低表达(图2C)。

图1 NEFL基因在食管鳞癌组织中的表达情况

A：GEO数据集GSE23400中基因mRNA在食管鳞癌组织中的表达量高于配对的食管正常上皮组织(= 53)；B：qRT-PCR检测食管鳞癌和配对食管正常上皮组织中基因mRNA的相对表达量(= 27)，使用2–ΔΔCt法计算相关基因表达量；C：Western blot检测在食管鳞癌和配对食管正常上皮组织中NEFL蛋白表达水平(= 27)，以GAPDH为内参；D：使用Image J.2.6计算对应蛋白条带灰度值：蛋白的相对表达=靶蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值。N：正常组织；T：肿瘤组织。*< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001, ****< 0.0001。

图2 NEFL基因mRNA和蛋白水平在食管鳞癌细胞系中的表达

A和B：使用CCLE中的基因表达数据集分析不同肿瘤细胞系中基因mRNA表达的平均值(A)和中位值(B)；C：Western blot检测8个食管鳞癌细胞系中NEFL蛋白的表达。

2.3 NEFL过表达促进食管鳞癌细胞的增殖

选取NEFL蛋白表达水平较高的KYSE70和KYSE140细胞系进行敲降实验。在KYSE70和KYSE140细胞系中敲降后(图3A)，检测细胞增殖能力的变化。结果表明，在敲降后48 h内，基因敲降组和对照组之间的细胞增殖能力没有显著差异，但在基因敲降两天后，基因敲降组的细胞增殖能力略低于对照组(图3B)。

2.4 NEFL过表达促进食管鳞癌细胞的侵袭和迁移

在KYSE70和KYSE140细胞系中敲降后，检测了食管鳞癌细胞的侵袭和迁移能力的变化。结果表明，敲降组的细胞穿过聚碳酯膜数目远远少于对照组(< 0.001) (图4，A和B)。同时，本课题组构建了pcDNA3.1-NEFL瞬时过表达载体，选取NEFL低表达细胞系KYSE510外源过表达NEFL。结果显示，与pcDNA3.1空载组相比，过表达NEFL可显著促进食管鳞癌细胞的侵袭和迁移(< 0.05) (图4，C和D)。

图3 NEFL过表达促进食管鳞癌细胞的增殖

A：Western blot检测KYSE70和KYSE140细胞中瞬时敲降效果，以GAPDH为内参；B：CCK8法检测瞬时敲降后KYSE70和KYSE140细胞增殖能力的变化。Parental：亲本组；Non-silencing：对照siRNA；siNEFL-1/-2：NEFL siRNA靶点1和2。*< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001, ****< 0.0001。

图4 NEFL过表达显著促进食管鳞癌细胞的侵袭和迁移

A：敲降的KYSE70和KYSE140细胞与对照组中穿过聚碳酯膜的细胞数目对比；B：敲降的KYSE70和KYSE140细胞与对照组中聚碳酯膜下表面的5个不同视野的统计分析结果；C：瞬时过表达NEFL的KYSE510细胞与对照组中穿过聚碳酯膜的细胞数目对比，pcDNA3.1：空载质粒；pcDNA3.1-NEFL：NEFL外源瞬时过表达载体；D：瞬时过表达NEFL的KYSE510细胞与对照组中聚碳酯膜下表面的5个不同视野的统计分析结果。*< 0.05, ***< 0.001, ****< 0.0001。

2.5 NEFL过表达可能促进食管鳞癌细胞发生EMT

研究报道，E-cadherin和N-cadherin是参与肿瘤细胞EMT过程中的关键分子[11]。因此本课题组检测了敲降后E-cadherin和N-cadherin的表达情况。结果显示，敲降后，食管鳞癌细胞系E-cadherin的表达水平明显升高，同时N-cadherin的表达水平明显降低(图5A)。相反，与pcDNA3.1空载对照相比，过表达NEFL后，E-cadherin的表达水平明显降低，且N-cadherin的表达水平明显升高(图5B)。这些结果表明，基因可能通过促进EMT增强食管鳞癌细胞的侵袭迁移能力。

2.6 NEFL过表达激活EGFR/AKT/S6信号通路

Western blot结果显示，与亲本和对照组相比，敲降的KYSE70和KYSE140细胞中EGFR的蛋白水平显著降低，且AKT和S6的磷酸化水平也显著降低(图6A)。相反，外源过表达NEFL的KYSE510细胞系中EGFR的蛋白水平、以及AKT和S6的磷酸化水平显著升高(图6B)。为了确定EGFR是NEFL调节食管鳞癌细胞侵袭迁移能力的关键下游分子，本研究在敲降后回复EGFR表达。Western blot结果表明，与对照组相比，实验组EGFR的总蛋白表达水平、以及EGFR、AKT和S6的磷酸化水平均显著恢复(图6C)。同时，Transwell实验结果显示敲降后外源转染pcDNA3.1- EGFR过表达载体的细胞穿过聚碳酯膜数目多于对照组(< 0.01) (图6，D和E)。上述结果表明，EGFR是NEFL的关键下游分子，NEFL过表达可能通过激活EGFR/AKT/S6信号通路，促进食管鳞癌细胞的侵袭和迁移。

图5 NEFL过表达调控促进食管鳞癌细胞发生EMT的关键分子的表达

A：敲降，Western blot检测E-cadherin和N-cadherin的表达变化；B：外源过表达NEFL，Western blot检测E-cadherin和N-cadherin的表达变化。

2.7 敲降NEFL降低EGFR基因mRNA水平

本研究进一步分析了NEFL过表达是否通过调控基因mRNA水平进而影响其蛋白水平。qRT- PCR结果显示，与对照组相比，敲降后KYSE70和KYSE140细胞中的基因mRNA水平显著降低(< 0.0001) (图7A)。使用GEO数据集GSE23400分析食管鳞癌中基因mRNA的表达。结果显示，食管鳞癌组织中基因mRNA的表达量显著高于正常组织(= 53，< 0.0001) (图7B)。同时，利用GEO数据集GSE23400分析了与基因mRNA表达的相关性。结果显示，食管鳞癌组织中mRNA的表达与mRNA的表达呈正相关(= 53，< 0.0001) (图7C)。

2.8 敲降NEFL降低食管鳞癌细胞的体内成瘤能力

本研究成功构建了慢病毒介导的稳定敲降KYSE70细胞系(图8A)，将其与对照组细胞分别接种于裸鼠腋下。成瘤实验结果显示，与对照组相比，敲降组肿瘤明显减小(图8B)。统计学数据分析显示，敲降组的移植瘤体积和重量均明显降低(图8C)。进一步对移植瘤组织蛋白进行了Western blot检测，结果显示，敲降下调了移植瘤中N-cadherin的表达，并上调了E-cadherin的表达(图8D)。

3 讨论

转移是癌细胞从其肿瘤发生的原发部位扩散到身体其它部位的一个涉及多分子、多步骤的复杂生物学过程，是癌症多步骤过程中最致命的因素[12,13]。NEFL在多种肿瘤中发挥重要作用，然而，在食管鳞癌中的作用尚无文献报道。本研究发现与正常组织相比，食管鳞癌组织中基因mRNA和蛋白水平显著上调。功能研究表明，NEFL过表达可以促进食管鳞癌细胞侵袭迁移，且增强食管鳞癌细胞在体内的致瘤能力。

最近的研究表明，NEFL在86.7% (26/30)的胃癌肿瘤组织中存在阳性表达，且NEFL可能在胃癌细胞的EMT过程中发挥作用[6]。EMT已被广泛认为是多种癌细胞局部浸润和远处转移的必要过程[14～16]。E-cadherin的表达降低、以及Vimentin和N-cadherin的表达增加是EMT过程的基本特征[17]。本研究发现降低NEFL的表达导致E-cadherin表达显著增加，同时N-cadherin表达显著降低，提示NEFL可能通过降低E-cadherin和增加N-cadherin激活EMT过程，促进食管鳞癌细胞的侵袭和迁移，为NEFL促进食管鳞癌细胞的侵袭提供了分子基础。但如上所述，NEFL在胶质瘤中下调，其高表达与患者的良好预后呈正相关[8,9]。由此推测NEFL在恶性肿瘤中的作用可能取决于不同的肿瘤类型。

图6 NEFL过表达激活EGFR/AKT/S6信号通路

A：Western blot检测瞬时敲降后KYSE70和KYSE140细胞中的分子变化，以GAPDH为内参；B：Western blot检测瞬时过表达NEFL后KYSE510细胞中的分子变化，以GAPDH为内参；C：在KYSE70和KYSE140细胞转染siNEFL和质粒，Western blot检测细胞中的分子变化，以GAPDH为内参；D：在KYSE70和KYSE140细胞中敲降并回复EGFR后三组中穿过聚碳酯膜的细胞数目对比，siNEFL：siRNA靶点2；pcDNA3.1：空载质粒；pcDNA3.1-EGFR：EGFR外源过表达载体；E：KYSE70和KYSE140细胞敲降并回复EGFR后三组中聚碳酯膜下表面的5个不同视野的统计分析结果。**< 0.01，***< 0.001，****< 0.0001。

图7 NEFL与EGFR基因mRNA表达水平呈正相关

A：敲降后，qRT-PCR检测的mRNA水平；B：基因mRNA在食管鳞癌组织中的表达水平高于配对正常组织(= 53；GEO数据集GSE23400)；C：根据GEO数据集GSE23400的分析，基因mRNA表达水平与mRNA表达水平呈正相关。

图8 敲降NEFL降低食管鳞癌细胞的裸鼠成瘤能力

A：Western blot检测shRNA的稳定敲降效果，以GAPDH为内参，shNon-silencing：对照；shNEFL-1：稳定敲降靶点1；B：稳定敲降的KYSE70细胞及对照细胞在裸鼠体内的成瘤效果；C：与对照相比，稳定敲降KYSE70细胞的裸鼠体内移植瘤体积和重量显著降低；D：Western blot检测敲降的裸鼠肿瘤组织中E-cadherin和N-cadherin的表达，以β-actin为内参。**< 0.01。

EGFR是一种具有细胞内酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白[18]。众所周知，EGFR的过表达在多种实体瘤中起着重要的致癌作用，其异常激活被认为是细胞恶性转化和肿瘤转移的主要原因[19]。研究表明，食管鳞癌存在高频EGFR高表达，EGFR过表达与临床分期、肿瘤侵袭和淋巴结转移密切相关[20]。基因拷贝数较低的食管鳞癌患者的生存率高于其拷贝数较高的患者[21]。EGFR的激活可触发一系列下游信号通路的活化，主要涉及癌细胞增殖、侵袭和转移相关的MAPK和PI3K/AKT通路[22]。本研究发现，敲降可显著降低基因mRNA和蛋白水平的表达，并导致AKT和S6的磷酸化水平显著降低，表明NEFL可能上调基因mRNA水平，激活EGFR/AKT/S6信号通路，进而促进食管鳞癌细胞的侵袭。在敲降后过表达EGFR时，食管鳞癌细胞的侵袭和迁移能力得到了显著的回复，进一步验证了NEFL过表达通过激活EGFR/AKT/S6增强食管鳞癌细胞侵袭和迁移能力。此外，本研究通过GEO数据库分析得到，基因mRNA的相对表达量与基因mRNA的相对表达量呈显著正相关。然而，NEFL是否通过调控基因的转录水平进而影响其mRNA水平尚不清楚。根据文献报道，多个转录因子可调控EGFR的表达，例如Sp1[23]、E1A[24]、AP2[25]、YB-1[26]等。后续研究将重点关注NEFL是否调控上述转录因子，以及如何通过转录因子调控的表达。

综上所述，本研究发现在食管鳞癌细胞和组织中高表达，且NEFL通过激活EGFR/AKT/S6信号通路，促进食管鳞癌细胞发生EMT，进而增强食管鳞癌细胞的侵袭迁移能力(图9)。上述研究表明，靶向NEFL/EGFR信号通路可能作为食管鳞癌的一种潜在治疗策略。

图9 NEFL通过激活EGFR/AKT/S6信号通路促进食管鳞癌细胞的侵袭迁移模式图

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NEFL promotes invasion and migration of esophageal squamous carcinoma cellsthe EGFR/AKT/S6 pathway

Zhilu Fan1, Liyan Yang2, Na Zhang1, Dan Feng1, Jing Guo1, Chen Chang1, Qing Yuan1, Yan Cai1, Yu Zhang1, Wenqiang Wei3, Mingrong Wang1, Jiajie Hao1

To explore the expression, the roles and the underlying mechanism of neurofilament light chain (NEFL) in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC), we firstly analyzed themRNA and protein expression in ESCC and paired normal tissues by using Gene Expression Omnibus (GEO) database, and real-time quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR). The results showed thatmRNA level was significantly upregulated in ESCC tissues compared with that of normal tissues. Western blot analysis revealed that NEFL protein level was also significantly upregulated in ESCC tissues. CCK8 and transwell assays were performed to analyze the effect of NEFL overexpression on the malignant phenotypes of ESCC cells, and the results showed thatknockdown significantly impaired the ESCC cell invasion and migration. Xenograft assay in nude mice indicated thatsilencing suppressed tumor growth. At the molecular level,knockdown significantly upregulated E-cadherin and downregulated N-cadherin expression, suggesting that NEFL overexpression might influence the epithelial-mesenchymal transition (EMT) process. Furthermore, we found thatknockdown significantly reduced the mRNA and protein expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) and the phosphorylation levels of protein kinase B (PKB; also known as AKT) and ribosomal protein S6 (S6). Ectopic expression of EGFR afterknockdown significantly restored the phosphorylation levels of AKT and S6 as well as the invasion and migration of ESCC cells. These data indicate that NEFL overexpression might promote the EMT process of ESCC cellsthe EGFR/AKT/S6 pathway, ultimately enhancing the invasion and migration of ESCC cells.

NEFL; esophageal squamous cell carcinoma; invasion and migration; EGFR; EMT

2022-01-24;

2022-02-22;

2022-03-07

国家自然科学基金项目(编号：81972770)，中国医学科学院医学与健康科技创新工程(编号：2021-I2M-1-018)和中国医学科学院肿瘤医院潜力培育计划(编号：PY2018B01)资助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81972770), Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) Innovation Fund for Medical Sciences (No. 2021-I2M-1-018), and the Potential Development Projects of Cancer Hospital, CAMS (No. PY2018B01)]

范志露，在读硕士研究生，专业方向：细胞生物学。E-mail: 18679148679@163.com

郝佳洁，博士，研究员，研究方向：肿瘤遗传学、肿瘤细胞生物学。E-mail: hjj8173@126.com

杨荔艳，博士，研究实习员，研究方向：肿瘤遗传学、检验学。E-mail: yangliyan0729@163.com

10.16288/j.yczz.22-019

(责任编委: 周钢桥)