哺乳动物早期胚胎发育的体外研究

王梓川，张嘉祺，李磊

哺乳动物早期胚胎发育的体外研究

王梓川1,2，张嘉祺1,2，李磊1,2

1. 中国科学院动物研究所，干细胞与生殖生物学国家重点实验室，北京干细胞与再生医学创新研究院，北京 100101 2. 中国科学院大学存济医学院，北京 100049

哺乳动物胚胎发育起始于受精卵，受精卵依次形成桑椹胚和囊胚。同时，早期胚胎从输卵管迁入子宫，植入母体子宫后通过原肠运动形成原肠胚并进一步发育为新生个体。哺乳动物体内生命孕育方式造成研究取材和观察等方面的困难，阻碍了人类对哺乳动物胚胎发育过程的认识。因此，必需开发哺乳动物体外胚胎技术，以克服体内发育方式所带来的研究困难。2021年12月，杂志公布了2021年十大科学突破，“体外胚胎为人类早期发育研究开辟新的方向”位列其中。本文对哺乳动物体外胚胎的研究历史和最新进展进行评述，同时探讨这些新技术在相关领域研究中的应用，以期为人类早期胚胎发育和相关疾病研究带来启示。

早期胚胎发育；胚胎体外培养；人早期胚胎样结构；类囊胚

哺乳动物胚胎发育起始于受精卵，随后受精卵开始卵裂并从输卵管向子宫迁移。胚胎早期发育最先由受精卵中的卵母细胞来源的物质主导，直至合子基因激活，此后的发育逐渐转变成由合子转录的产物调控[1,2]。合子基因激活后,早期胚胎通过卵裂增加细胞数量，随着卵裂的继续进行，胚胎发育到桑椹胚，发生致密化，同时发生第一次细胞谱系分化，形成具有内细胞团(inner cell mass, ICM)和滋养外胚层(trophectoderm, TE)的囊胚。小鼠()和人()囊胚分别形成于E3.5～4.5 (embryo 3.5～4.5)和E6～7时期[3]。在晚期囊胚阶段(小鼠E4.5，人E7.0)，胚胎到达子宫，通过滋养外胚层识别，并植入母体子宫，与母体建立联系以继续胚胎发育。

小鼠和人胚胎的植入过程和植入后发育存在较大差异。胚胎的滋养外胚层与ICM接触的部分为极滋养外胚层，围绕囊胚腔不接触ICM的为壁滋养外胚层，它们将发育成为胚外组织。在小鼠胚胎E4.5时期，壁滋养外胚层介导胚胎与子宫内膜的粘附，极滋养外胚层发育为胚外外胚层。人胚胎则通过极滋养外胚层介导，在E7～12期完成粘附和植入过程。植入后，小鼠上胚层细胞由幼稚状态(naïve state)转变为活化态(formative state)[4]，同时伴随着上皮化和极性出现，胚胎形成中央有腔的“花环”结构[5,6]。人胚胎在E8时期，中央腔扩张，形成前羊膜腔；在E12～13时期，胚胎呈盘状结构(图1)。在E5.5胚胎时期，在形成“花环”结构后，胚外外胚层近胚胎端内陷形成另外一个腔，两个腔融合形成前羊膜腔[6]，小鼠胚胎呈卵柱状。此后，胚胎的上胚层后部形成原条，启动原肠运动。通过原肠运动形成外胚层、定型内胚层和中胚层，它们是胚胎各类组织和器官形成的基础[7～9]。小鼠的原肠运动发生在大约E6.0时期，而人胚胎的原肠运动则发生在大约E14时期。

胚胎在母体子宫内发育，给相关过程的研究带来了操作困难和取材不易等问题。此外，由于小鼠与人的早期胚胎发育存在明显差异(图1)，基于小鼠的研究结果并不易解释人类早期胚胎发育事件和调控机制。实际上，人类很早就有人造子宫的想法，并发明了新生儿重症监护中心NICU (a neonatal intensive care unit)，挽救了很多高危新生儿的生命。如何不依赖母体子宫，体外培养哺乳动物着床以后的胚胎一直是领域的关注点；此外，人类胚胎研究材料受限也是早期胚胎发育领域亟需解决的问题。最近，新的小鼠胚胎体外培养体系的建立以及人的类囊胚样结构的成功构建，为哺乳动物尤其是人类的早期胚胎发育相关疾病研究提供了新的技术平台。相关研究成果被评为2021年度十大科学突破之一。本文将分别对这些研究进行论述，以期为哺乳动物胚胎体外发育和人类疾病相关研究提供参考。

图1 小鼠和人早期胚胎发育过程

小鼠和人的受精卵通过有丝分裂增加细胞数量，同时进一步分化，形成由外层细胞包绕内部腔体和细胞团的囊胚；随后胚胎进入子宫腔，发生着床并植入子宫内，此时小鼠胚胎呈卵柱状，而人类胚胎则呈双层盘状结构；此后胚胎的上胚层通过原肠运动形成三胚层，并以此为基础形成各种组织和器官。

1 哺乳动物早期胚胎体外培养

为了克服植入后胚胎观察的困难，研究人员很早就尝试体外培养小鼠胚胎。早先，研究人员利用鼠尾胶原蛋白和大鼠血清，尝试将小鼠囊胚培养至卵柱状结构阶段，甚至到早期体节发生阶段[10～12]。除了静态条件下培养小鼠囊胚，也有研究者尝试滚筒等动态方式培养着床以后的胚胎[13,14]。但这些方法存在效率低下、体外培养时间不长等问题。目前，人们有关哺乳动物胚胎早期发育的认识，主要通过解剖怀孕各阶段胚胎结合基因敲除小鼠等技术获得[9]。

通过将囊胚体外培养技术与成像系统结合，研究者描述了小鼠胚胎着床期间的卵柱状结构形成、前后体轴建立等形态发生事件[15]。近几年，国内外数个研究团队在体外将人胚胎培养至E13～E14，并利用多种技术手段从谱系分化、表观修饰等角度对体外培养胚胎进行描绘[16～18]。还有团队构建了人早期胚胎的三维培养体系，将人胚胎培养至原条原基(primitive streak anlage)形成阶段[19]。由于人胚胎体外培养不得超过14天，国内两个研究团队独立在体外将食蟹猴()的胚胎培养至原肠运动阶段(E20)，并研究了非人灵长类胚胎原肠运动阶段的重要事件，为人早期胚胎发育和早期细胞谱系分化等研究提供了重要线索[20,21]。

2021年3月，来自以色列的研究团队在发表了一种小鼠胚胎体外培养方法[22]，能将植入后、原肠运动前的小鼠胚胎(E5.5)培养至器官发生阶段(E11)。该团队集成多套气体控制模块，建立了一种滚筒培养系统，实现了对O2、CO2含量以及容器内气压的精准控制。利用该系统，研究人员首先实现在无母体子宫支持下，将小鼠原肠运动晚期的胚胎(E7.5)体外培养4天，使其发育至后肢形成阶段(～E11)，效率可达到77%；这些体外培养的胚胎具有44对体节，体长近似体内发育的同时期胚胎。为了进一步探索更早期的胚胎发育，他们同时建立了原肠运动前胚胎(E5.5)至原肠运动后胚胎(E8.5)的静态体外培养体系[22]。结合上述两种培养体系，该团队最终成功将小鼠E5.5胚胎在体外连续培养6天，使其发育至42对体节期，效率可达20%。免疫荧光染色及单细胞测序分析显示，体外培养的各阶段胚胎和体内发育的对应时期胚胎在细胞类型和关键基因表达方面相似，说明体外培养胚胎能较好重现体内胚胎发育过程[22]。

无母体子宫条件下的胚胎体外培养系统可以为研究哺乳动物胚胎原肠运动前后发生的关键事件提供重要平台。例如，研究人员将外源基因载体通过电穿孔或慢病毒转染方式导入胚胎，结合成像技术，可以直观观察胚胎的神经管闭合等事件以及致畸物质对胚胎发育的影响[22]；此外，他们将荧光标记的人原始小胶质祖细胞注射到小鼠E7.5胚胎中，经过体外培养，发现人小胶质祖细胞可以稳定增殖并迁移到小鼠大脑中[22]；他们还将小鼠上胚层干细胞(epiblast stem cells, EpiSC)和上胚层样干细胞(epiblast- like stem cells, EpiLC)注射到胚胎中，通过该培养系统，观察到近似以前报道的体内胚胎注射的嵌合效率[22～25]。但是，在该研究系统中，小鼠胚胎体外培养至大约E11时期后快速死亡，无法继续发育，说明目前的系统还很难替代母体子宫发育环境。如果该系统能够在大动物，特别是在人类的胚胎中获得成功应用，将对早期高危新生儿助产系统产生重要影响；此外，结合囊胚体外发育系统和体外授精等技术[16,18,20,21,26]，有望在体外实现全过程的哺乳动物胚胎发育，将极大促进哺乳动物的体外生命孕育研究。

2 人类早期胚胎样结构构建

人早期胚胎发育研究除了受伦理限制外，还受到材料稀少的严重制约[27]。胚胎干细胞的建立，特别是近年来新建立的各种阶段的人和小鼠胚胎干细胞系，明显促进了对哺乳动物早期胚胎发育和细胞谱系形成的认识[28～33]。此外，研究人员利用胚胎干细胞可以自组装成早期胚胎样结构的特性，部分模拟胚胎发育过程，为早期胚胎发育研究提供了新的方向[34～38]。

2021年3月，美国西南医学中心和澳大利亚蒙纳士大学的两个研究团队独立构建了人类早期胚胎样结构[39,40]。幼稚态人胚胎干细胞(naïvehuman embryonic stem cells, naïvehES)具有向胚胎和胚外组织发育的双向潜能，利用这一特性，西南医学中心的研究者将这些细胞在三维培养条件培养，经过数天，发现这些naïvehES自组装成具有空腔的人类囊胚样结构(以下称类囊胚)。优化培养基及实验起始细胞数后，类囊胚的形成效率可达12.8%。他们构建的类囊胚包括内细胞和滋养外胚层样的结构，具有与人囊胚相似的上胚层、下胚层和滋养外胚层标记物的表达和分布模式；但这些类囊胚的上胚层样细胞多而另外两类细胞偏少[39]。单细胞转录组分析进一步证明这些类囊胚与E5～E7时期的人胚胎相似。蒙纳士大学的研究团队则是在研究人皮肤成纤维细胞重编程的过程中，意外发现重编程后的细胞可以自组装成囊胚样结构[40]。于是，他们将能够自组装的重编程细胞培养于三维环境中，同样得到了在胚层标记物表达模式和转录组水平与人囊胚相似的类囊胚[40]。此外，两个团队都利用类囊胚成功建立了具有胚胎组织分化潜能的多能干细胞系、具有胚外组织分化潜能的滋养层干细胞系、及能够形成胚外内胚层的细胞系。同年，其他研究团队也利用幼稚态人胚胎干细胞和人扩展性多能干细胞(exten­ded pluripotent stem cell, EPSCs)构建了人类早期胚胎样结构[41～43]。

人早期胚胎样结构具有类似人早期胚胎细胞的组成和转录组等特征，可部分模拟早期胚胎发育过程，可能解决人类胚胎研究材料的制约问题，为人早期胚胎发育和谱系形成提供了重要研究工具。相较于胚胎自然发育的体内环境，体外培养系统更易于控制发育变量，方便研究者对胚胎施加各种干扰因素，探讨它们对胚胎发育的影响。因此这些体外重构模型为研究人类早期胚胎发育、出生缺陷和流产等重大疾病研究提供了重要平台。尽管研究人员能从多种细胞系构建人早期胚胎样结构，但这些模型都存在成功效率低和部分细胞类型不明确等问题。基于小鼠胚胎相似的研究可以推测，目前构建的人早期胚胎样结构无法发育为可存活的个体[38]。因此，这些模型仍需要进一步优化。这种基于干细胞的体外胚胎模型是否备与人类胚胎相等的伦理与法律地位值得社会各界关注和广泛讨论。目前有关人类的胚胎体外培养和类胚胎的伦理和法律准则可能面临调整，以适应快速发展的人类早期胚胎发育研究[27]。

3 结语与展望

哺乳动物体外胚胎不仅可能克服研究技术和材料的制约，还可能避免伦理方面的研究限制，为哺乳动物特别是人类早期胚胎发育和相关疾病研究提供了新的研究手段和方法。结合新的人工胚胎和体外胚胎培养、体外受精、NICU等技术，有望摆脱母体子宫，在体外全程实现哺乳动物胚胎发育。目前体外胚胎尤其是早期胚胎样结构与体内发育胚胎还存在明显差异，相关技术有待于进一步完善。此外，这些技术发展需要伦理和法律的规范和约束，亟需社会各界共同参与，讨论并制定适合相关领域发展的新条例和法规。这些新的发展方向和研究动态可能明显促进人类对早期胚胎发育的认识和重大疾病的防治。

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investigation of mammalian early embryonic development

Zichuan Wang1,2, Jiaqi Zhang1,2, Lei Li1,2

Mammalian embryonic development starts from a fertilized egg, which cleaves to form morula and blastocyst. At the same time, the early embryo is transported from the fallopian tube to the uterus for implantation. After implantation, the embryo undergoes gastrulation and forms a gastrula, further developing a new individual. The development of embryo in the uterus causes the difficulties in sampling and observation, hindering the understanding of mammalian embryonic development. Therefore, it is necessary to develop the technology to overcome the barrier ofembryonic development. In December 2021, “Embryo ‘husbandry’ opens windows into early development” was selected as one of’s 2021 breakthroughs. This review focuses on the achievements ofmammalian embryos and discusses their limitations and the future applications for the investigation of mammalian embryonic development and human related diseases.

early embryogenesis;culture of mammalian early embryo; human early embryo-like structures; blastoids

2022-02-14;

2022-03-18;

2022-03-28

国家重点研发计划(编号：2018YFC1004500，2021YFC2700300)和国家自然科学基金项目(编号：31930033)资助[Supported by the National Key R&D Program of China (Nos. 2018YFC1004500, 2021YFC2700300) and the National Natural Science Foundation of China (No. 31930033)]

王梓川，在读硕士研究生，专业方向：人体解剖与组织胚胎学。E-mail: wangzichuan@ioz.ac.cn

李磊，博士，研究员，研究方向：哺乳动物早期胚胎发育。E-mail: lil@ioz.ac.cn

10.16288/j.yczz.22-034

(责任编委: 陆发隆)