增强子调控癌症发生发展的机制研究

漆思晗，王棨临，张俊有，刘倩，李春燕,3,4

增强子调控癌症发生发展的机制研究

漆思晗1,2，王棨临1,2，张俊有1,2，刘倩1,2，李春燕1,2,3,4

1. 北京航空航天大学，医学科学与工程学院，北京 100191 2. 北京航空航天大学，生物与医学工程学院，北京 100191 3. 北京航空航天大学，大数据精准医疗高精尖创新中心，北京 100191 4. 北京航空航天大学，工业和信息化部大数据精准医疗重点实验室，北京 100191

增强子是一段具有转录调控功能的DNA序列，主要通过顺式调控方式发挥作用。由于增强子及其调控基因在位置和距离上的不确定性，大大增加了研究增强子作用机制的复杂性和困难性。越来越多的证据表明，增强子与癌症等疾病的发生发展密切相关，因此开展癌症相关增强子的研究，将有助于全面解析癌症发病机制，并推动抗肿瘤药物的高效研发，具有重要的社会意义和经济价值。目前对于增强子的鉴定不充分，增强子在癌症和其他疾病中的发生发展调控机制尚未得到完整的解析。本文主要对增强子和超级增强子及其特性进行介绍，并在全基因组水平上对增强子的预测和鉴定进行了描述，最后总结了近年来增强子在癌症等疾病发生过程中所发挥的调控作用，从而为未来解析增强子调控机制以及癌症的诊断和治疗提供参考。

增强子；超级增强子；癌症；调控机制

在高等真核生物中，由于胚胎发育过程中的细胞分化，使得基因的表达调控变得十分复杂。基因表达及其调控是所有多细胞生物发育和生长的关键，不同的基因以细胞类型特异性的方式被激活，从而成为具有特殊形态和功能的细胞类型[1]。人类()基因组包括了编码区和非编码区，其中大部分为非编码区。由于非编码区不能够翻译出蛋白，因此人类基因组中大部分非编码区曾被看作是没有功能的DNA。近年来测序技术的不断发展，位于非编码区的基因组也得到了更为深入的研究。人们发现虽然位于非编码区的序列无法翻译出功能蛋白质，但却可以作为基因调控元件(如启动子、增强子和超级增强子等)，在基因的表达过程中发挥调控作用[2]。转录是从基因组DNA转录到RNA的过程，是机体中基因表达的开始，也是表达过程中调控最严格的步骤之一，而转录水平上的调控异常会导致多种发育障碍和疾病(如癌症)[3]。启动子的位置相对固定，与基因之间有特定的距离和方向，通常在转录起始位点附近。然而启动子自身表现出较低的活性，基因表达的细胞类型特异性和增强的转录活性通常是由增强子决定的。

增强子是由200～1500个碱基对组成的具有调控基因表达功能的DNA序列，其上包含有序列特异性的转录因子识别与结合位点，增强子通过这些位点与转录因子结合，进而启动靶基因的转录[4]。大多数管家基因的增强子位于启动子附近，但精确区分这些调控元件之间的边界存在困难[5]。增强子和其所调控的基因在方向以及距离上不固定：在调控的方向上，有些增强子处于靶基因的3′端，有些可处于5′端，有些增强子甚至处于所调控基因的内含子中[4]。在调控的距离上，相关研究也已经发现增强子在与靶基因相距Mb数量级的距离上也可以促进其调控基因的转录。例如，小鼠()()基因的肢芽增强子，该增强子距离基因的启动子1 Mb以上，仍可以对启动子进行调控[6]。增强子调控靶基因转录的能力取决于与对增强子活性产生积极或消极影响的转录因子结合位点的组合，以及给定细胞的细胞核内增强子结合转录因子的相对浓度[7]。虽然增强子与其调控的靶基因在DNA序列上相距一定的距离，但二者在染色质的三维结构空间上通过形成三维环状的Loop结构彼此靠近，进而促进靶基因的表达(图1)。本文介绍了增强子的概念和特性，对增强子鉴定的方法进行了描述，并进一步归纳总结了增强子在癌症发生发展过程中调控机制的系列研究。

1 增强子及其特性

在基因组上启动子和增强子是两种主要的转录调控元件。启动子决定转录的起始，而增强子则对转录进行进一步的加强。增强子的研究最初是在来自猿猴病毒40 (simian virus 40, SV40)时提出，这是一种可以诱发肿瘤形成的DNA病毒。1981年，Banerji等[8]发现当使用β-珠蛋白基因质粒重组物时，转录本几乎无法被检测到，而当β-珠蛋白基因重组物含有SV40 DNA时，β-珠蛋白基因的转录水平大大提高。含有增强子元件的病毒DNA片段可以在许多位置以任一方向起作用，包括兔β-珠蛋白基因转录起始位点的上游1400 bp或下游3300 bp，而这种可以增强基因转录的调控元件也被命名为增强子SV40[9]。增强子作为一种转录调控元件，在调控方面具有不依赖于与靶基因间距离和方向的灵活性，也因此大大增加了全面鉴定基因组中的增强子和作用于单个基因的全部增强子的困难。基因的启动子可以简单地通过对其mRNA的5′端进行测序来识别，但没有类似的明确标准可以依据靶基因确定增强子的位置。研究表明，H3K27ac (histone H3 lysine 27 acetylation)和H3K4me1 (histone H3 lysine 4 monomethylation)组蛋白标记是增强子活性的显著特征，常用于识别基因组中的增强子[10]。此外，增强子作为调控元件发挥作用时具有细胞特异性，并且在特定细胞类型中只有通过和特定的转录因子结合，才能够发挥调控作用。增强子的这种在不同细胞类型中发挥不同调控活性的特点也使其在机体的基因表达过程中成为一种重要的调控元件[11]。

图1 增强子与超级增强子的对比

A：增强子组成结构；B：超级增强子组成结构。增强子通过转录因子、调节蛋白复合体以及RNA聚合酶Ⅱ与启动子形成三维环状结构进而增强靶基因的转录水平；超级增强子区域则招募聚集更多的转录因子进而结合更多的调节蛋白复合体和RNA聚合酶Ⅱ，从而实现对靶基因的调控；超级增强子增强转录的效果比普通增强子高出一个数量级。

近年来通过对增强子作用机制的不断研究，增强子的作用特点和生物学功能被研究人员逐步发现。首先，具有活性的增强子位于基因组的染色质开放区域，增强子的活性与核小体中的组蛋白修饰(例如H3K4me1和H3K27ac)、DNA甲基化修饰以及转录因子的结合密切相关。其次，增强子发挥转录调控作用时一般会与启动子形成三维环状结构，二者间的联系可以通过Mediator调节蛋白复合体来介导[12](图1A)。活性增强子具有双向转录的特性，并且其局部染色质较为松散会暴露出与RNA聚合酶以及转录因子特异性结合的位点，并通常伴有H3K4me1的修饰。当结合的转录因子完全激活增强子时，局部染色质开放，进而募集RNA聚合酶II以启动双向转录，产生增强子RNA (enhancer-derived RNAs,eRNAs)。所以，eRNA的表达水平代表了增强子的激活程度，也能够作为增强子活性的标志之一[13]。增强子的转录最初报导于20世纪90年代早期，直到2010年以后，两篇关于eRNA的报道证明了具有H3K4me1标记的增强子普遍转录成非编码RNA，这些非编码RNA被命名为eRNA，RNA聚合酶Ⅱ介导的双向eRNA转录，其长度通常在0.5～2 kb，eRNA的表达水平与附近基因的信使RNA合成水平呈正相关，说明eRNA合成发生在活性增强子上，因此eRNA可以作为增强子鉴定的标志物之一[14,15]。从2007年开始，随着DNA测序技术的飞速发展，二代测序技术为在全基因组水平系统寻找和鉴定增强子带来了机遇。例如，通过在全基因组范围内分析与特定蛋白结合的DNA序列，如与p300的结合或与具有H3K4me1以及H3K27ac修饰的组蛋白结合的DNA序列，从而实现对增强子的鉴定[16]。

2 超级增强子(super-enhancers, SEs)

目前研究发现常见的复杂疾病(包括癌症、阿尔茨海默病、Ⅰ型糖尿病和系统性红斑狼疮等)和超级增强子之间相互关联。Hnisz等[17]通过对与疾病特征相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymor­phisms, SNP)位点分布分析表明，大部分SNP 位点位于非编码区域(93%)，而在这些非编码区域中，调控元件增强子占比高达2/3，并且显著富集在超级增强子上。超级增强子是可以调控转录的一簇增强子，其大小有时可达数万bp[18]。与增强子类似，超级增强子作为一种调控元件也能够调节基因的表达，并且富集了高密度的关键转录因子、转录辅因子、特定表观修饰的组蛋白(H3K4me1和H3K27ac)以及RNA聚合酶II复合物，相比于增强子，这些因子的结合密度高达10倍[19]。基于上述特征，超级增强子能够驱动靶基因的转录水平更高(图1B)。Whyte等[20]在增强子的研究基础上对超级增强子进行定义：超级增强子由许多小的增强子串联组成，这些增强子间的距离非常接近，长度大概在8～20 kb，并且在驱动基因表达方面能力更强。超级增强子在功能上可以激活与细胞特异性相关的基因及其表达，并且在癌症等疾病的发生发展中起着重要作用。Hnisz等[17]在小鼠的胚胎干细胞中发现了超级增强子，并发现细胞中包含的多个转录因子(例如Oct4、Sox2、Nanog、Klf4等)均富集在超级增强子区域。此外，转录辅因子以及RNA聚合酶II复合物等与调控基因表达密切相关的物质也均富集在超级增强子上，这使得超级增强子与增强子相比调控靶基因转录的能力更强，同时产生的eRNA水平也更高。癌细胞中超级增强子在癌基因上富集，如在癌基因位点附近[19]。

3 增强子的研究方法

增强子的鉴定研究为解析其在肿瘤生物学中的意义发挥重要作用，然而增强子在调控基因表达时方向和位置的不确定性加大了增强子的鉴定困难[21～23]。究其原因主要有：(1)增强子与其调控的靶基因在位置上灵活多变。例如增强子不一定会影响在距离上与其相邻的基因表达，而通过三维结构的折叠来调控位于不同的染色体上的基因。(2)增强子与其调控的靶基因不是一一对应的，一个增强子可以对多个基因的表达进行调控。(3)增强子位于非编码区，与编码基因相比，其研究范围更广。(4)增强子拥有组织细胞特异性，其表达活性受到时间和环境等条件的影响。但目前测序技术的快速发展为增强子的研究和鉴定带来了新的机遇。

3.1 转录因子基序法

通过测定并且比较不同物种的遗传信息，发现增强子元件通常富集在物种高度保守的序列中[24]。早期增强子的预测常使用比较基因组法和转录因子基序法。比较基因组法是利用增强子富集在高度保守序列中的特性，通过比较不同物种间的基因组来进行增强子的研究鉴定。但尽管如此，由于其位于染色体非编码区，与编码区基因序列相比，增强子的保守性相对较差，因此通过上述方法来预测增强子的效率较低。转录因子基序法是通过增强子上与转录因子结合的DNA基序(DNA motif)来预测和鉴定增强子，作为增强子序列特异性的转录因子结合位点，其所含有的DNA motif长度仅6～10 bp[11]。依赖于如此短序列的预测必将带来较高的假阳性。因此仅通过基因组或基序的保守特性来预测特定细胞类型中增强子活性是不够的，需要新的方法来预测和鉴定增强子的活性特征，新一代测序技术和基因编辑技术的快速发展为增强子在全基因组水平的鉴定和预测提供了新的策略。

3.2 RNA-seq技术

RNA-seq是高通量测序中最常见的一种应用，已成为分子生物学中无处不在的工具。它通过在全转录组范围内分析差异基因表达和mRNAs的可变剪接等，促进了人们对基因组功能理解的方方面面[25,26]。RNA-seq在癌症研究领域也有广泛的应用，例如检测正常组织和肿瘤组织在药物治疗前后二者间的差异[27]。2010年Kim等[15]通过RNA-seq分析发现，神经元细胞发生基因转录时，不仅在启动子区域附近转录出mRNA，增强子区域也转录出RNA——eRNA。随着RNA测序技术的不断发展，GRO-seq (global run-on sequencing)、PRO-seq (precision nuclear run-on sequencing)和TT-seq (transient transcriptome sequencing)等技术通过检测体内新合成的RNA，来分析和鉴定特定细胞系或组织中有活性的增强子，并可对其表达的eRNA进行定量[28～32]。2018年，Chen等[33]使用TCGA（The Cancer Genome Atlas）中RNA-seq数据对33种癌症类型的8928个肿瘤样本进行全基因组分析，发现处于激活状态的增强子广泛存在于肿瘤样本中。2019年，Zhang等[34]通过RNA-seq数据的再分析，筛选出16种癌症类型中差异表达的eRNA，并发现在肿瘤样本中这些eRNA表达明显上调。因此，RNA测序技术可通过对eRNA的分析和鉴定，解析增强子在癌症诊断和治疗中的作用。

3.3 ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin using sequencing)技术

ATAC-seq技术，即利用转座酶来研究可及性染色质的高通量测序技术，最初由Buenrostro等[35]在2013年提出。当染色质处于复制或转录状态时，DNA高级结构解开，染色质变得松散开放，转座酶Tn5可以插入到这些染色质开放区域内；通过对Tn5插入区域的高通量测序，鉴定处于转录活跃的染色质开放区域[36]。这一技术目前也被用于有活性增强子的鉴定，ATAC-seq技术利用高通量测序技术对转座酶Tn5易接近的开放染色质进行捕获，预测有活性的增强子。与ChIP-seq相比，ATAC-seq对检测有活性增强子更加敏感，而且需要的起始材料也更少。

3.4 ChIP-seq技术

ChIP-seq技术是表观基因组研究的核心方法，通过检测与增强子结合的转录因子或特殊修饰的组蛋白如H3K27ac和H3K4me1等，对有活性的增强子进行鉴定。ChIP-seq用到的主要工具是染色质免疫沉淀技术，是一种测定蛋白质-DNA结合的技术，也称为结合位点分析法，由Orlando等[37]在1997年提出。ChIP-seq依赖于蛋白质与特定DNA元件的交联，通过特异性抗体富集蛋白质-DNA复合物，进而对回收的DNA片段进行高通量测序。借助增强子所结合蛋白质的特异性抗体，一方面可以鉴定候选增强子的序列；另一方面，也可以更加准确的找到增强子与转录因子结合的序列。ChIP-seq所产生的信息极大地促进了对增强子、转录因子、辅因子和组蛋白修饰在调节基因表达中的机制解析。转录因子与增强子上相应位点结合，转录辅助因子则在转录因子的介导下被招募至相应的位点，协助RNA聚合酶与启动子区域结合，进而起到调控靶基因转录的功能[38]。研究表明，增强子区域的组蛋白修饰与增强子活性密切相关：活性增强子通常富集H3K27ac和H3K4me1的组蛋白修饰，而当增强子处于静态时，与其结合的组蛋白主要是H3K4me1和H3K27me3 (Histone H3 lysine 27 trimethylation)的组蛋白修饰[39～41]。因此，增强子上不同组蛋白的结合常被用于增强子活性的鉴定，同时也用于预测增强子的位置等。

3.5 CUT&RUN (cleavage under targets and release using nuclease)和CUT&TAG (cleav­age under targets and tagmentation)技术

CUT&RUN技术是由Skene和Henikoff[42]在2017年研发的一项DNA-蛋白质相互作用的技术，该技术利用洋地黄皂苷增加细胞的通透性，在靶蛋白抗体的介导下Protein A-微球菌核酸酶(pA-MNase)聚集在靶蛋白周围，通过Ca2+的激活作用使得pA- MNase在靶蛋白两侧进行切割，通过抗体将靶蛋白富集，然后将与其结合的DNA释放出来用于后续DNA的提取、文库制备和测序[43]。2019年，他们在CUT&RUN技术的基础上进行技术升级，衍生出了CUT&TAG技术。与CUT&RUN技术相比，CUT&TAG技术通过Protein A与Tn5转座酶构成的融合蛋白(pA-Tn5)切割目的蛋白附近的DNA片段，并在pA-Tn5切割的过程中接上建库引物接头，不需要末端补平和连接接头，通过进一步简化实验操作提高了实验效率[44]。ChIP-seq技术所涉及到的甲醛固定步骤，可能会由于空间位置相近的蛋白质与DNA之间发生交联，导致捕获到不相关的染色质片段，产生假阳性。CUT&RUN和CUT&TAG技术将与蛋白结合的DNA保护起来，其两端通过转座酶的插入实现DNA的片段化。通过富集这些片段并测序，鉴定与靶蛋白结合的DNA片段。与ChIP-seq技术相比，这两项技术改进了ChIP-seq在研究DNA与蛋白质相互作用方面的不足，无需甲醛固定和超声打断DNA，具有所需细胞数量少、操作简单、信噪比高等优点，为后续增强子等相关调控元件的研究提供更加高效的方法。

3.6 基因编辑技术CRISPR (clustered regularly interspersed short palindromic repeats)

CRISPR是非常有效、快捷和廉价的基因编辑技术，通常应用于在细胞中实现基因的敲除。CRISPR发现于1987年[45]。2002年，被Jansen等[46]命名为“CRISPR”。而CRISPR-Cas (CRISPR-associated)系统作为原核生物中的一种适应性免疫系统，主要包括了CRISPR和编码Cas蛋白的基因，目前研究已经发现了等多种类型的Cas蛋白，其中Cas9应用最为广泛[47]。CRISPR-Cas9技术由单向导RNA (single guide RNA, sgRNA)和DNA内切酶Cas9组成，前者将后者引导至特定的DNA序列，以切割双链DNA位点[48]。自从CRISPR-Cas9在首次被用于基因组编辑工具以来，其应用范围一直在不断扩展，不仅能够修饰细胞和生物体的基因组序列，还可以引入表观遗传和转录修饰[49,50]。目前，CRISPR-Cas9技术可用于鉴定内源性增强子元件，并研究增强子存在与否对基因表达的影响。2016年，Korkmaz等[51]研究在癌症的发生和进展中起着关键作用的两种转录因子p53和ERα，通过CRISPR-Cas9技术构建靶向增强子的质粒，并使用细胞转染等方式将其导入细胞，最终实现对增强子的敲除，用以鉴定和表征人体中有功能的增强子。上述研究结果表明，能够通过基因编辑技术CRISPR-Cas9敲除具有调控癌基因表达的增强子，来研究其对癌症发生机制的影响，进而确定功能增强子的调控机制，解开人类基因组上增强子等非编码调控元件的功能。

目前已有多项研究结合使用上述方法，来进行增强子鉴定和功能的研究。例如，日本理化学研究所RIKEN启动的FANTOM (Functional Annotation of the Mammalian genome)计划利用RNA-seq、ChIP-seq以及基因表达加帽分析(cap analysis of gene expression, CAGE)技术，结合多种组蛋白修饰H3K4me1、H3K27ac和H3K27me3，总共鉴定出了大约65,000个增强子[14]。eRNA和增强子调控的靶基因在表达水平上具有正相关性，因此可以通过RNA水平的关联分析筛选出增强子可能调控的靶基因，并且利用ChIP-seq在基因组上寻找H3K4me1和H3K27ac富集的区域，进而在特定类型的细胞中找到有活性的增强子。在解析增强子及其调控的靶基因间的作用机制方面，可以利用CRISPR-Cas9技术，通过设计sgRNA敲除增强子，进而开展后续调控机制的研究[33,52]。此外，在预测调控泛癌相关的焦亡基因增强子时，本课题组通过多种癌细胞系的ChIP-seq数据发现增强子GSDMD-enh3周围有H3K27ac和H3K4me1强结合峰，这说明GSDMD-enh3是有活性的增强子；通过结合Hi-C数据，验证了增强子GSDMD-enh3和在染色体上可能直接结合，并在癌细胞系K562、HCT116以及人类胚胎干细胞系H1中利用ChIP-seq数据预测增强子GSDMD-enh3通过上游转录因子USF1调节表达[53]。

4 增强子与癌症发生的关系

癌症已然成为影响社会发展的重大阻力，据国际癌症研究机构统计的数据表明，2020年全球已有1930万例新增癌症病例和近1000万例死亡，并预估在接下来的20年里，癌症病例数将以47%的比例上升[54]。已有大量全基因组关联分析(genome wide association study, GWAS)的研究显示，与疾病或特征相关联的变异富集在非编码调控区，尤其是细胞特异性强的增强子区域[55～57]。除了DNA水平的突变，增强子和超级增强子在癌基因或抑癌基因的表达调控中扮演着重要角色。是癌症发生过程中最重要的癌基因之一，其在一半以上的肿瘤中表达上调[58]。Korkmaz等[51]借助CRISPR-Cas9技术敲除肺癌细胞中与距离相距约450 kb的增强子，发现增强子敲除后的表达降低，肺癌细胞的增殖和迁移能力也随之降低。此外，相关研究鉴定出一种位于下游1.4 Mb的增强子N-Me，N-Me与近端启动子相互作用并诱导表达，同时发现该增强子缺失的小鼠其胸腺细胞增殖和分化能力显著降低。增强子N-Me作为参与人类白血病发病机理的致癌增强子，与该病的发病机制密切相关[59]。的过表达可以通过多种机制实现，包括拷贝数增加、染色体易位或体细胞突变等，位于非编码区的增强子也可以通过调控表达来影响癌症的发生[60]。研究显示增强子的异常(改变转录因子结合位点产生新增强子的点突变、拷贝数变异或基因组结构重排导致的增强子活性异常等)与癌症的发生发展或治疗效果有很强的相关性[61,62]。

本文综述和总结了增强子区域的五种变异形式(点突变、拷贝数变异、基因组重排、DNA甲基化以及结合的组蛋白修饰改变等)与癌症的发生发展紧密相关(图2)。增强子的点突变可能会通过改变转录因子结合位点来调控癌基因表达，一方面可能通过获得新的结合位点导致癌基因异常表达；另一方面通过丢失转录因子结合位点使原本表达的抑癌基因不能正常表达，导致癌症发生。例如，Akhtar-Zaidi等[63]通过ChIP-seq分析组蛋白标记发现一处增强子区域点突变导致结肠癌中的抑癌基因表达受到抑制，进而促进癌症发生(图2A)。拷贝数变异(copy number variation, CNV)在癌细胞中普遍存在，是遗传结构变异的重要组成部分，通常定义为扩增或减少的DNA区段大于1 kb的事件。CNV通过影响基因表达水平，与许多癌症的发展和进展高度相关[61]。Zhang等[64]通过对12种肿瘤类型进行体细胞拷贝数分析和组织特异性表观遗传学分析，在癌基因附近发现了超级增强子的局部扩增。因此，增强子/超级增强子上发生CNV使得增强子促进的癌基因表达能力大大提高，进而促进癌症发生(图2B)[65]。Wang等[66]首先开发了NeoLoopFinder方法，用以预测发生“增强子劫持”的增强子，并在前列腺癌细胞中利用CRISPR-Cas9技术敲除其中一个增强子，发现预测的靶基因——癌基因的表达量大大降低，这说明由基因组重排引发的增强子劫持可能使增强子与癌基因在三维空间上产生互作，从而增强癌基因的表达，促进癌症发生。因此，基因组重排导致的“增强子劫持”使得增强子被移位到癌基因附近，进而激活癌基因的表达，从而引发癌症(图2C)。此外，增强子发生甲基化也可能与肿瘤发生相关[63,67]。与非肿瘤组织相比，肝癌患者中C/EBPβ eRNA水平升高，并与C/EBPβ增强子甲基化呈现出负相关：C/EBPβ增强子的低甲基化与HCC患者的较差预后相关[68]。Aran等[69]利用ENCODE（Encyclopedia of DNA Elements）网站分析58种细胞类型的DNA甲基化数据发现，增强子甲基化在癌症中显著变化：与低甲基化增强子相关的基因在癌症中倾向于上调，而与高甲基化增强子相关的基因在癌症中倾向于下调(图2D)。与增强子结合的相关染色质组蛋白修饰常在癌细胞中发生改变，并与癌症治疗的耐药性相关。例如，内分泌治疗的耐药性发生在大约50%的乳腺癌患者中，内分泌治疗耐药性乳腺癌细胞依赖于NOTCH信号通路，当乳腺癌细胞中增强子上H3K27ac信号升高时，抗药性增加[70]。当增强子处于静态时，其上通常伴有H3K27me3修饰，癌基因表达受到抑制；而当增强子处于活跃状态时，伴有组蛋白H3K4me1和H3K27ac修饰，会增强癌基因的表达，促进癌症发生(图2E)。

图2 增强子变异与癌症发生

增强子上点突变、拷贝数变异、基因组重排、DNA甲基化以及组蛋白修饰在癌症发生过程中的作用如图中所示。A：增强子上发生的点突变使得抑癌基因转录受到抑制，从而促进癌症的发生；B：增强子拷贝数的变异会增强癌基因的表达，进而促进癌症发生；C：发生基因组重排会导致增强子位于癌基因附近，进而增强癌基因的表达；D：增强子的DNA甲基化会抑制癌基因的表达；E：静态增强子通常伴有H3K27me3修饰，癌基因表达受到抑制，而活性增强子常伴有H3K4me1和H3K27ac组蛋白修饰，能够增强癌基因表达，促进癌症发生。

编码癌基因的染色体外DNA (extrachromomal DNA, ecDNA)是癌症基因组的普遍特征，也是癌症发展的有力驱动因素，可以通过基因扩增和改变基因调控来介导癌基因的高表达[71]。由于缺乏着丝粒，ecDNA在细胞分裂过程中会随机分离到子细胞中，这使得其在细胞中可以得到快速积累。此外，ecDNA能够重新整合到染色体中，因此也可能作为一些染色体扩增的前体。ecDNA上具有高度易结合的染色质以及调控基因表达的增强子元件，研究表明，相比于线性染色体上的增强子，呈圆环状ecDNA上存在的增强子其激活癌基因的表达能力更高，这也是癌细胞中常常存在ecDNA的原因之一[72]。2021年，Hung等[73]发现在癌细胞分裂间期期间，ecDNA会出现相互聚集的现象，这种局部聚集能够促进增强子–基因相互作用进而致使癌基因过表达，同时发现由蛋白质BRD4相连的ecDNA中心能够实现分子间的转录调控，进而作为癌症治疗的潜在靶点(图3)。总的来说，癌症发生通常与增强子的表观遗传变化有关，并且增强子相关组蛋白修饰的突变或错误调节也有可能会对增强子的活性产生影响。调控癌基因表达的增强子被激活后使得癌基因表达水平发生提高，进而导致癌症的发生[74]。因此，研究增强子的发生及作用机制对于后续癌症的治疗有着重要意义。

图3 ecDNA上增强子的致癌机制

环状ecDNA上的增强子在癌症发生中的致癌机制如图所示。ecDNA常分布于癌细胞中，位于环状ecDNA上的增强子其调控癌基因表达量与线性DNA相比大大增加，在癌细胞分裂间期ecDNA会出现聚集现象形成“ecDNA簇”进一步加强癌基因表达，促进癌症的发生。

研究发现，超级增强子在多种肿瘤类型中处于异常激活状态，并能够通过调控癌基因的表达，介导癌症的发生[75]。Glodzik等[76]通过使用分段常数拟合方法系统地研究了560例乳腺癌患者的染色体重排，确定出了33个与乳腺癌相关的突变特征，并发现它们大部分富集在超级增强子区域。此外，Hnisz等[56]建立了86种人类细胞和组织类型的超级增强子目录，发现与癌症等疾病相关的DNA序列变异富集在和疾病相关细胞的超级增强子上。通过识别和绘制超级增强子并破坏它们，有望改变临床癌症等疾病的治疗方式。上述这些发现表明超级增强子能够调控和癌症等疾病发生发展相关基因的表达，为癌症特异性病理学提供生物标志物，这有助于进一步了解癌症等疾病的诊断和治疗。

5 增强子与癌症治疗

对癌症发生机制的研究、对早期癌症诊断生物学标志物的筛选以及对个体化治疗方案的探索将显著改善人类健康和延长人类寿命、减轻社会负担和推动社会经济发展。增强子产生的RNA—eRNA，因在介导增强子功能和基因转录方面的潜在作用，以及它们与疾病相关的遗传变异，引起了人们的广泛关注。研究发现，eRNA—AP001056.1，可作为头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell car­cinoma, HNSCC)的预后标志物，并且此eRNA与HNSCC的相关性有着显著的特异性[77]。Zhang等[34]通过整合来自TCGA、CCLE（Cancer Cell Line Encyclopedia）、ENCODE、FANTOM和Roadmap Epigenomics项目的多组学数据共鉴定出9108种eRNA，其中652种普遍存在于各种癌症类型中，约占eRNA种类的7%；而癌症类型特异性的5332种eRNA约占59%，依据这些癌症类型特异性的eRNA可以很好地区分癌症。eRNA靶向治疗通过靶向特定的eRNA，实现癌症类型特异性或癌症患者特异性的癌症干预治疗[78]。与相邻的正常组织相比，许多eRNA在肿瘤样本中过度表达，这一现象与癌症中增强子的过度激活一致，这提示靶向eRNA治疗癌症的潜力[33,79]。eRNA作为癌症治疗的靶点在其他研究中也得到了证实。例如，雌激素可能通过诱导eRNA来促进前列腺癌的发生，Ding等[80]发现通过敲低eRNA能够抑制癌细胞的增殖、侵袭和迁移并促进癌细胞的凋亡，这为前列腺癌的治疗提供了潜在的治疗靶点。此外，Hsieh等[81]利用siRNA敲低eRNA发现：eRNA表达降低，前列腺癌细胞增殖受到抑制。因此，通过靶向特定的eRNA，有希望能够实现癌症的干预治疗。此外，eRNA也可以预测癌症治疗的效果。在多种癌症类型中，增强子9 (chr9: 5580709-5581016)的表达水平与程序性死亡配体1 (PD-L1)的表达水平之间存在相关性[33]。由于基因表达已被用作预测癌症免疫治疗疗效的重要标志物，因此，eRNA表达作为免疫治疗效果的预测标志物，具有潜在价值。

尽管目前在开发抗癌疗法方面取得了许多进展，但抗癌药物的耐药性仍然是促进癌症复发的主要原因，肿瘤的异质性也使得治疗耐药性的研究更具挑战性。例如，40%～55%的三阴性乳腺癌患者对化疗和放疗产生耐药性，大约40%的非小细胞肺癌患者由于耐药性复发而导致死亡，20%的淋巴细胞白血病和儿童癌症产生耐药性导致疾病的复发，因此确定癌症耐药性机制在癌症治疗中十分重要[82～84]。虽然人们逐渐发现了增强子在治疗癌症耐药性过程中的作用，但eRNA在癌症耐药性中的具体作用尚不清楚。已有研究发现，eRNA在乳腺癌中大量表达，而eRNA的过表达导致乳腺癌细胞MCF7对药物BEZ235和Obatoclax产生耐药性[34]。Zhao等[85]敲低eRNA 发现去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer, CRPC)细胞的活力在很大程度上降低了，这表明eRNA在CRPC细胞生长和增殖过程中发挥重要作用。因此，代表了一类非常规的基因，除了作为生物标志物外，还可以从其增强子中产生具有重要功能的eRNA，在肿瘤的治疗中发挥重要作用。

6 结语与展望

人类基因组中的非编码序列在多种生物学过程中发挥着至关重要的作用，作为在基因组中占比约98%的非编码区域，仍有大量是功能未知的，这些曾被认为是基因组中“垃圾”的区域，已被逐渐证实存在重要功能。基因组的三维结构会影响基因的转录调控或其他细胞生命活动，例如增强子通过与启动子形成的三维环状结构已经被证明与癌症和其他疾病的发生发展密切相关。同时，改变非编码序列能够改变染色质结构，例如增强子劫持现象以及切除一些拓扑结构相关结构域的边界序列导致的异常基因表达，都会诱发疾病产生。但目前，在癌症发生发展过程中发挥作用的增强子并未被充分挖掘，并且已经鉴定出来的增强子对靶基因的调控机制也没有得到全面清晰的解析。此外，非编码序列在结构上的重要性目前也没有系统性的研究，尤其是一些与增强子相关或功能元件注释的区域。经过30多年的研究，人们对增强子的作用机制有了一定的了解，但其在生物学其他一些重要方面仍有待阐明，包括确切的序列范围、不同转录因子和辅助因子的精确作用以及增强子与其靶启动子的连接等。在过去几年中，对不同癌症类型(包括实体瘤和不同形式的白血病)的全基因组测序和全基因组关联研究越来越清楚地表明，许多增强子上的染色质修饰在癌症发病机制和其他疾病中起着核心作用。由于与癌症发生发展有联系的遗传变异富集在非编码区的增强子区域而非基因的编码区域，同时增强子在癌细胞与正常细胞中存在显著差异(如eRNA水平高低、增强子区域内的DNA甲基化水平和组蛋白修饰等)，因此，更多地了解增强子和超级增强子的作用机制和二者在癌症等疾病发病机制中所发挥的功能，对今后癌症等疾病的诊疗改进有着重要作用。

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[85] Zhao Y, Wang LG, Ren SC, Wang L, Blackburn PR, McNulty MS, Gao X, Qiao M, Vessella RL, Kohli M, Zhang J, Karnes RJ, Tindall DJ, Kim Y, MacLeod R, Ekker SC, Kang T, Sun YH, Huang HJ. Activation of P-TEFb by androgen receptor-regulated enhancer RNAs in castration-resistant prostate cancer., 2016, 15(3): 599–610.

The regulatory mechanisms by enhancers during cancer initiation and progression

Sihan Qi1,2, Qilin Wang1,2, Junyou Zhang1,2, Qian Liu1,2, Chunyan Li1,2,3,4

Enhancer is a DNA sequence, and mainly acts into regulate gene transcription. Due to the uncertainty in both location and distance between enhancers and their target genes, it is more complex and difficult to study the underlying regulatory mechanism of enhancers. Accumulating evidences indicate that enhancers are closely associated with the occurrence and development of diseases, such as cancer. Therefore, the studies of enhancers in cancer will be helpful to deeply unravel cancer pathogenesis and to promote the development of antitumor drugs. The related research is with great social significance and economic value. Currently, the identification of enhancers is insufficient. The regulatory mechanisms by enhancers during the initiation and progression of cancer and other diseases have not been fully delineated. In this review, we provide an overview of enhancers, super enhancers and their properties, followed by a description of enhancer prediction and identification at the genome-wide level. Finally, we summarize the regulatory roles of enhancers during diseases such as cancer in recent years, thereby providing a reference for the future exploration on enhancer regulatory mechanisms as well as cancer diagnosis and treatment.

enhancers; super enhancers; cancer; regulatory mechanisms

2021-12-31;

2022-03-05;

2022-03-15

国家自然科学基金项目(编号：82072499, 31801094)和北京航空航天大学青年科学家创新团队支持计划(编号：YWF-21-BJ-J-T105)资助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 82072499, 31801094), and Young Scientist Innovation Team Support Program of Beihang University (No. YWF-21-BJ-J-T105]

漆思晗，在读硕士研究生，专业方向：生物医学工程。E-mail: ZY2010120@buaa.edu.cn

李春燕，博士，副研究员，研究方向：肿瘤基因组学。E-mail: lichunyan@buaa.edu.cn

10.16288/j.yczz.21-440

(责任编委: 于明)