分析小鼠昼夜节律变化的行为学方法

曾义准，张陶，徐璎

分析小鼠昼夜节律变化的行为学方法

曾义准，张陶，徐璎

苏州大学苏州医学院，剑桥–苏大基因组资源中心，苏州 215123

昼夜节律是指生命活动以24小时为周期的内在性节律。为了适应昼夜环境周期性的变化，地球上几乎所有生物体，包括藻类、细菌、植物、动物等，都演化出一个特殊的系统——生物钟，用以指挥不同组织与器官来适应环境的昼夜交替，维持机体的生理稳态和行为与环境昼夜变化同步。生物钟是指由内源性分子时钟控制的日周生理振荡过程，人类生命活动的各个层面，包括行为、生理、代谢等都受到生物钟的调控，并表现出明显的昼夜节律，如睡眠与苏醒、警觉程度与运动能力、体温波动、泌尿系统、激素分泌、免疫调节以及细胞因子释放等。昼夜节律紊乱可能影响各种疾病的发生、发展、治疗和预后。因此在机体的发育、衰老及疾病的发生、发展过程中评估昼夜节律是否异常具有重要的意义。结合本课题组相关研究，本文较为系统性地讨论了几种适用不同目的鉴别昼夜节律行为异常的方法，分享了具体的实验操作以及分析思路，包括利用代谢笼测量活动节律、自由跑轮活动监测、倒时差、长光照、骨骼光周期以及T7-cycle，并解释了不同行为学方法背后的生理意义。除此之外，本文还探究了不同遗传背景以及不同来源小鼠的昼夜节律在适应外界环境变化上的可能差异，为相关研究提供了可行的参考。根据这些原则及方法，以期帮助相关科研人员选择合适的实验来评估遗传因素、环境因素或疾病对昼夜节律行为的影响。

昼夜节律；代谢笼；跑轮；测量方法

为了适应24小时昼夜变化的外界环境，地球上的生物进化出了昼夜节律系统。机体的许多生理过程，如睡眠/觉醒、活动、激素分泌等都表现出近24小时周期的节律[1,2]。昼夜节律系统几乎参与了机体所有生理活动的调节[3]。昼夜节律紊乱会对健康造成重大影响，包括睡眠障碍、肿瘤发生、代谢紊乱、免疫系统疾病等。对轮班工人的研究表明，长期的轮班工作会影响机体的脂质和碳水化合物的代谢，改变胰岛素抵抗水平以及生长激素和皮质类固醇分泌模式[4～6]。此外，流行病学研究显示，一些疾病如高血压、左心室肥大、冠心病和心机梗塞在轮班工作人群中发生更频繁更严重[7～9]。而最近的全基因组关联分析(genome-wide association studies, GWAS)也将睡眠障碍、心理健康和代谢紊乱等疾病的病因学与生物钟联系起来[10]。因此，昼夜节律与生理稳态和疾病是密切相关的。

哺乳动物的昼夜节律系统受生物钟调控，生物钟是由核心生物钟基因构成的转录翻译反馈环。小鼠()体内几乎每一个细胞内都存在生物钟，实现昼夜节律的调控。生物钟基因缺失或突变能够导致小鼠生物钟的紊乱，行为学上可以观察到内在节律丧失、周期偏离正常范围[11～13]，而这些突变小鼠分别有睡眠、代谢、生殖、肿瘤等不同的表型，提示了生物钟基因或生物节律的改变与疾病有密切的关联。

由于光线是昼夜节律系统中最有力的授时因子，光照对昼夜节律系统的同步是普遍存在的现象[14]。对于小鼠来说，光照是影响昼夜节律变化的最重要环境因素，可以重置小鼠的昼夜节律，通过牵引作

用实现小鼠昼夜节律与外界环境同步[15]。在现实生活中，跨时区飞行、季节性日照时间的改变，都是外界光照对机体昼夜节律牵引的现象[16]。许多基因突变小鼠都表现出适应外界光照变化能力的改变[17～19]。光线还可以直接对小鼠的活动起到抑制作用(masking)。机体对光照的响应很大程度上依赖昼夜节律系统，因此人们通常可以利用不同的光照周期、光照时间点、光照强度来检测小鼠昼夜节律系统对于光线的响应，记录小鼠的行为变化，进而分析某些基因的缺陷是否对生物节律产生影响[20]。

本文以Slc7a11突变小鼠为例，使用不同的昼夜节律行为学检测方法对小鼠进行行为学表型检测[21]，包括代谢笼、小鼠自由跑轮活动监测、倒时差反应、长光照、骨骼光周期和T7-cycle等。本文对小鼠昼夜节律的行为学检测方法进行了较为全面的总结，提供了一套系统性、标准化的检测方法和分析思路，并阐述了这些行为学方法的生物学意义。这些实验方法可以作为昼夜节律表型分析的筛选流程。此外，文中还对昼夜节律检测过程中可能遇到的问题、可能导致的原因包括遗传背景及灯光强度等因素进行了分析，强调了遗传背景在此过程中发挥的作用，以期能有效帮助研究人员规避评估小鼠昼夜节律行为学检测中可能遇到的问题。

1 材料与方法

1.1 小鼠饲养

本实验使用的Slc7a11突变小鼠来自于苏州大学剑桥–苏大基因组资源中心，C57BL/6J和C57BL/6N小鼠分别购买于江苏集萃药康生物科技股份有限公司、北京维通利华实验动物技术有限公司和斯贝福(苏州)生物技术有限公司。实验动物均饲养于苏州大学剑桥–苏大基因组资源中心SPF级设施中，小鼠饲养环境温度为22±2℃，环境湿度为60%～70%，小鼠饲养在标准光照环境中(8:00开灯，20:00关灯)，并自由取得食物和饮水。所有动物实验方案经过苏州大学剑桥–苏大基因组资源中心动物伦理与使用委员会批准通过(CAM-SU-AP#: YX- 2017-1)。

1.2 小鼠昼夜节律检测方法

1.2.1 代谢笼检测小鼠昼夜节律

代谢笼由检测活动、食物、水、氧气含量和二氧化碳含量等检测模块和数据记录、数据储存等模块组成的一套实验动物监测系统。该系统可以连续实时记录小鼠活动、进食、饮水、氧耗量和二氧化碳产生量[22]。本文以Slc7a11突变小鼠和野生型小鼠为例，使用美国哥伦布公司搭建的代谢笼系统(Coulumbus Instruments, CLAMS)。用代谢笼检测小鼠活动和饮食昼夜节律过程的具体操作如下：将小鼠单独放置于代谢笼的笼盒内，前3 d为适应阶段，从第4 d开始记录，第4 d至第6 d每隔20 min记录小鼠活动、饮食和饮水数据，连续记录3 d (附图1A)。适应阶段以及记录阶段小鼠所处环境皆为正常饲养环境，光照周期为标准光照周期(8:00开灯，20:00关灯)。

1.2.2 跑轮检测小鼠内在昼夜节律周期

小鼠跑轮活动由生物节律监测系统记录，该系统购置于武汉一鸣智能科技有限公司。与代谢笼相比，跑轮记录是检测小鼠活动昼夜节律的经典设备，可以长期检测小鼠活动的节律，被广泛运用于异常小鼠昼夜节律的筛选，发现了一系列昼夜节律异常的突变体[23]。实验过程中，将小鼠单独放置于带有滚轮的笼盒中(苏州市冯氏实验动物设备有限公司)，在笼盒中小鼠自由获得食物和饮水。笼盒与记录仓相连，每个记录仓可以单独调节光照周期以及光照强度。小鼠在滚轮上每跑动一圈，记录仓便记录一次数据(附图1B)。

跑轮检测小鼠内在昼夜节律周期的具体操作过程如下：将小鼠单独放置于带有滚轮的笼盒中并置于记录仓中与记录系统连接。小鼠在标准光照环境中(8:00开灯，20:00关灯)牵引7～10 d，使得每一只小鼠的昼夜节律被外界光照稳定牵引。接下来关闭灯光，环境灯光变为持续黑暗，并至少记录14 d (图1A)。因为外界环境恒定，不存在影响小鼠内在昼夜节律的外界因素，所以持续黑暗中小鼠跑轮结果反映了小鼠内在的节律(free running)。随后根据跑轮记录到的小鼠在持续黑暗下活动可以计算得到小鼠的内在节律周期。周期可以根据在持续黑暗中小鼠跑轮活动的斜率计算得到(图1B，红线)，公式如下：

1.2.3 倒时差实验

为检测小鼠适应外界环境昼夜变化的能力，通常使用倒时差实验来检测小鼠被重新牵引的能力。倒时差实验具体操作步骤为：将小鼠单独放置于带有滚轮的笼盒中并置于记录仓中与记录系统连接，首先小鼠被置于标准光照环境中(8:00开灯，20:00关灯) 7～10 d，使得小鼠昼夜节律被稳定牵引；随后将开灯时间周期前移，如：2:00开灯，14:00关灯，模拟向东跨6个时区飞行。小鼠倒时差后驯化天数是视小鼠适应时差的天数而定(在完全适应新灯光后再驯化固定天数)。在小鼠跑轮活动被稳定牵引后，再将开灯时间后移，如：8:00开灯，20:00关灯，模拟向西跨6个时区飞行[24]。分别测量小鼠在2次倒时差过程中的起跳点时间的变化，来说明小鼠适应新时区的快慢，反应小鼠被再次牵引的能力(图1C)。随后根据小鼠完全适应新时区所需要的天数来反应适应环境变化的能力。

图1 小鼠昼夜节律检测方法光照方案示意图

A：跑轮检测小鼠内在昼夜节律周期。图中阴影部分对应的是关灯时间段，图中白色部分对应的是开灯时间段。B：小鼠内在昼夜节律周期计算方法示意图。红线表示小鼠跑轮起跳点的连线，绿线表示活动起跳点迁移的时间，蓝线表示持续黑暗中的天数。C：小鼠倒时差实验光照方案示意图。D：小鼠长光照实验光照方案示意图。E：小鼠骨骼光周期实验光照方案示意图。图中黄色部分表示15 min的光脉冲。F：小鼠T7-cycle实验光照方案示意图。图中黄色部分表示3.5 h光照。

1.2.4 长光照与短光照实验

倒时差实验模拟了跨越不同时区(经度)飞行，机体重新适应新的时区的过程。在同一地区，由于不同季节的日照情况不同，机体会利用昼夜节律系统来适应季节性光照的变化。在我国大部分地区，夏季日照时间长，冬季日照时间短，而夏至和冬至分别对应日照时间极长和极短的时间。

研究人员通常使用长光照或者短光照来反应小鼠适应季节性日长变化的能力。在实验中，小鼠被置于标准光照环境中(8:00开灯，20:00关灯) 7～10 d，使得小鼠昼夜节律被稳定牵引。然后，将光照时长改变，如：光照时间改为18 h，黑暗时间为6 h (5:00开灯，23:00关灯)，在小鼠跑轮活动被稳定牵引后，再恢复到标准光照环境(8:00开灯，20:00关灯)中(图1D)[25]。此外，还可以通过调节开关灯时间来缩短光照时间，探究小鼠适应短光照的能力。随后根据小鼠在长光照或者短光照下的活动时长来反映小鼠适应季节性日长变化的能力。

1.2.5 骨骼光周期实验

机体适应新的时区和长短光照，都是机体被外界光照牵引的过程。外界光照对小鼠的活动主要有牵引和抑制活动的作用。牵引作用是通过外界光照重置生物钟，影响小鼠活动的相位。光照抑制活动指的是光照可以直接抑制小鼠的活动量，即在小鼠活动时施加光照，小鼠的活动量会显著降低。因此，当小鼠在标准光照下活动相位出现异常时，可能是小鼠被外界光照牵引的能力异常，也有可能是小鼠活动被外界光照抑制的能力出现异常。

骨骼光周期实验就是用来检测外界光照对小鼠活动的牵引能力。在实验中，小鼠首先被置于标准光照环境(8:00开灯，20:00关灯)中7～10 d，使得小鼠昼夜节律被稳定牵引。然后，将光照条件调为持续黑暗，只在标准光照对应的开灯和关灯时间点给与很短的光照脉冲，最大程度地减少在实验过程中光照对小鼠活动的抑制作用，光照周期应该尽量接近小鼠内在节律的周期，如：8:00～8:15和19:45～20:00开灯，光照周期为24 h，其余时间保持黑暗(图1E)[26]。根据稳定牵引的定义，首先计算小鼠在骨骼光下的活动周期，是否和外界光照周期一致。然后，判断每个周期内小鼠活动的相位和光照的时间点关系是否稳定。根据这两个条件判断小鼠是否可以被外界光照稳定牵引。在稳定牵引的基础上再比较实验组和对照组小鼠活动的相位，如活动起跳点，说明两种小鼠活动相位的差异。

1.2.6 T7-cycle实验

光照除了可以重置小鼠活动的相位，实现对小鼠活动昼夜节律的牵引，还可以直接抑制小鼠的活动，减少小鼠的活动量。因此，在检测光照对小鼠活动量的抑制能力时，要尽可能排除光照的牵引作用。

T7-cycle是检测光照对小鼠活动抑制的常用方法。在实验中，光照条件设置为3.5 h开灯，3.5 h关灯，以此循环往复。此过程中，光照周期是7 h，与小鼠昼夜节律周期差距较大，且非24 h的约数，所以小鼠的昼夜节律不能被7 h光照周期牵引，实验结果最大程度上反应了光照直接对小鼠活动抑制作用(图1F)[27]。实验过程中小鼠被置于T7-cycle光照条件下至少7 d，因为在7 d的实验过程中各个7 h的时间窗口都会经历3.5 h光照～3.5 h黑暗的光照变化。随后通过统计小鼠的活动量来评价光照对小鼠活动的抑制作用。

1.3 统计分析

小鼠代谢笼数据的活动起跳点由同步筛选器识别[22]。小鼠跑轮活动起跳点由Clock lab软件识别。数据差异使用GraphPad软件(v6)的双侧Student’s检测。所有统计学检验中，<0.05表示有显著差异。

2 结果与分析

2.1 代谢笼初筛生物节律行为异常

当昼夜节律出现缺陷的时候，小鼠的活动和饮食规律有可能出现昼夜紊乱，而代谢笼具有实时记录活动及摄食的功能。本文以Slc7a11突变小鼠为例说明代谢笼对小鼠节律的检测(材料与方法1.2.1)。根据数据分析可以看到，第1 d和第3 dSlc7a11突变小鼠表现出活动起跳点提前的表型(图2A)。尽管在代谢笼中第2 d，Slc7a11突变小鼠和同窝野生型小鼠的活动起跳点没有明显差异，但在关灯时刻前后Slc7a11突变小鼠的活动比同窝野生型小鼠提前下降(图2A，红色箭头)。接下来，使用同步筛选器识别小鼠活动的起跳点时间和峰值相位，发现第1 d和第3 d时Slc7a11突变小鼠的起跳点时间提前(图2B)，第3 d时Slc7a11突变小鼠的峰值相位提前(图2C)。代谢笼不仅可以记录小鼠的活动还可以记录小鼠的进食，通过对Slc7a11突变小鼠和同窝野生型小鼠的进食量进行统计，发现Slc7a11突变小鼠和同窝野生型小鼠的进食节律模式没有明显差异，都是夜晚进食明显高于白天，只是在部分时间点Slc7a11突变小鼠进食量高于同窝野生型小鼠(图2D)。

2.2 利用跑轮检测小鼠内在昼夜节律周期

小鼠内在昼夜节律的周期是最容易检测的节律参数，此处以Slc7a11突变小鼠为例，说明小鼠的内在昼夜节律周期测量实验(材料与方法1.2.2)。在持续黑暗中野生型和突变小鼠都表现出明显的昼夜节律(图3，A和B)，通过计算发现Slc7a11突变小鼠和野生型小鼠的内在昼夜节律周期没有明显差异(图3C)。这个结果说明野生型和Slc7a11突变小鼠内在节律的快慢没有明显的差异。

2.3 利用跑轮测量小鼠对时差的响应

小鼠倒时差是检测小鼠适应外界光照变化的经典实验。本文以Slc7a11突变小鼠两次倒时差实验为例，介绍倒时差实验的过程(材料与方法1.2.3)。在向东(提前) 6 h倒时差的过程中野生型小鼠逐渐适应新的时区(图4A)，而Slc7a11突变小鼠出现一天就被牵引到新时区的现象(图4B)。向西(延迟) 6 h倒时差的过程中，野生型小鼠和Slc7a11突变小鼠没有表现出明显的差异(图4，A和B)。在向东调时差过程中，Slc7a11突变小鼠活动起跳点在前4 d明显早于野生型，能更早适应新时区，而向西调时差过程中小鼠活动起跳点没有差异(图4C)。

图2 代谢笼检测Slc7a11tm1a/tm1a突变小鼠活动变化

A：Slc7a11突变小鼠和同窝野生型小鼠在12 h光照/12 h黑暗光照条件下代谢笼监测的活动情况。Slc7a11突变小鼠和同窝野生型小鼠各10只小鼠，结果用Mean±SEM表示。ZT：给时者时间(zeitgeber time)；标准光照下ZT 0表示开灯时间点，ZT 12表示关灯时间点，ZT6指的是开灯后6 h，ZT18指的是关灯后6 h，以此类推。B：小鼠活动的起跳点时间统计图。结果用Mean±SEM表示。C：小鼠活动的峰值相位时间。结果用Mean±SEM表示。D：Slc7a11突变小鼠和同窝野生型小鼠在12 h光照/12 h黑暗条件下代谢笼监测的进食情况。结果用Mean±SEM表示。Slc7a11突变小鼠的活动、起跳点时间、峰值相位和进食量利用双侧Student’s检测；*<0.05，**<0.01，n.s.表示>0.05。图B、C数据来源本实验室先前的研究[21]。

图3 Slc7a11tm1a/tm1a跑轮活动昼夜节律周期

A：野生型小鼠跑轮图。B：Slc7a11突变小鼠跑轮图。Slc7a11突变小鼠和同窝野生型小鼠各8只，图中阴影部分对应的是关灯时间段，白色部分对应的是开灯时间段。C：野生型小鼠(蓝色)和Slc7a11突变小鼠(红色)跑轮活动的昼夜节律周期。结果用Mean±SEM表示，野生型和Slc7a11突变小鼠的数据使用双侧Student’s检测，n.s.表示>0.05。

图4 Slc7a11tm1a/tm1a突变小鼠对6 h相位前移和后移的响应

A：野生型小鼠6 h提前和延迟时差的跑轮图。图中红色线段表示活动起跳点。B：Slc7a11突变小鼠6 h提前和延迟时差的跑轮图。在第22 d小鼠跑轮距离中断了24 h，图中红色线段表示活动起跳点。C：野生型小鼠(蓝色，同窝野生型小鼠9只)和Slc7a11突变小鼠(红色，Slc7a11突变小鼠5只)适应6 h提前和延迟时差的活动起跳点变化曲线。图中阴影部分对应的是关灯时间段，白色部分对应的是开灯时间段，结果用Mean±SEM表示，野生型和Slc7a11突变小鼠的数据使用双侧Student’s检测，*<0.05。

2.4 利用长光照模拟季节适应

除了所在时区的变化，季节性日照时间长度的改变，也是一种常见的外界光照环境的变化。本文以Slc7a11突变小鼠适应长光照实验为例，介绍适应长光照的过程(材料与方法1.2.4)。在12 h光照条件下，小鼠活动集中在关灯时间段，转变为18 h光照时，小鼠的活动区间被压缩到约6 h，但小鼠活动仍然集中在关灯时间段(图5，A和B)。Slc7a11突变小鼠和野生型小鼠在适应长光照和恢复正常12 h光照的过程中，活动起跳点时间的变化情况一致，没有明显差异(图5C)。

2.5 利用骨骼光周期检测小鼠对光照牵引的响应

外界光照可以牵引小鼠的活动相位，又可以直接抑制小鼠的活动。通常使用骨骼光周期实验检测光照对小鼠活动的牵引能力。本文以Slc7a11突变小鼠对骨骼光照的响应为例，介绍该实验过程(材料与方法1.2.5)。在骨骼光照条件下，Slc7a11突变小鼠活动提前于光照脉冲，野生型小鼠在给予光照脉冲时开始活动，但是两种小鼠都保持着强健的节律(图6，A和B)，并且骨骼光周期下两种小鼠活动的周期仍然维持在24 h左右(图6C)。统计活动起跳点时间发现，Slc7a11突变小鼠活动起跳点明显早于野生型小鼠(图6D)。这说明光照脉冲可以牵引两种小鼠的活动，但是骨骼光周期对Slc7a11突变小鼠牵引时的相位角与野生型不同，暗示在小鼠昼夜节律于外界环境的同步化过程中发挥作用。

2.6 利用T7-cycle检测光照对小鼠活动的抑制作用

T7-cycle可以检测光照直接对小鼠活动的抑制作用。本文以Slc7a11突变小鼠在T7-cycle及3.5 h光照/3.5 h黑暗下的活动为例，介绍该实验过程(材料与方法1.2.6)。在T7-cycle条件下小鼠活动保持近24 h的活动周期(图7，A和B，红线区域)，并非跟随光照而变动。在小鼠活动时间段内，光照有效地抑制了小鼠活动(图7，A和B)。通过统计小鼠光照和黑暗期间小鼠活动量之比，说明光照对小鼠活动的抑制能力。定量结果显示，Slc7a11突变小鼠和野生型小鼠的活动量被光照抑制的程度相同，没有明显差异(图7C)。

图5 Slc7a11tm1a/tm1a突变小鼠长光照的适应

A：野生型小鼠适应18 h光照跑轮图。B：Slc7a11突变小鼠适应18 h光照跑轮图。A和B小图中红色线段表示活动起跳点，Slc7a11突变小鼠和同窝野生型小鼠各7只。C：野生型小鼠(蓝色)和Slc7a11突变小鼠(红色)适应18 h光照的活动起跳点变化曲线。图中阴影部分对应的是关灯时间段，白色部分对应的是开灯时间段，结果用Mean±SEM表示，野生型和Slc7a11突变小鼠的数据使用双侧Student’s检测，n.s.：>0.05。

图6 Slc7a11tm1a/tm1a突变小鼠在骨骼光周期下的跑轮活动

A：野生型小鼠在骨骼光周期下的跑轮图。同窝野生型小鼠6只。B：Slc7a11突变小鼠在骨骼光周期下的跑轮图。Slc7a11突变小鼠6只，图中红色线段表示活动起跳点，黄色线段表示15 min的光照脉冲。C：Slc7a11突变小鼠和野生型小鼠骨骼光周期下的周期统计。Slc7a11突变小鼠和同窝野生型小鼠各5只，结果用Mean±SEM表示，n.s.:>0.05。D：野生型小鼠(蓝色)和Slc7a11突变小鼠(红色)骨骼光周期下活动起跳点变化曲线。结果用Mean±SEM表示，野生型和Slc7a11突变小鼠的数据使用双侧Student’s检测。

图7 Slc7a11tm1a/tm1a突变小鼠T7-cycle下的跑轮活动

A：野生型小鼠在T7-cycle下的跑轮图。B：Slc7a11突变小鼠在T7-cycle下的跑轮图。A和B小图中红色线段内区间表示活动区域。Slc7a11突变小鼠和同窝野生型小鼠各7只。C：野生型小鼠(蓝色)和Slc7a11突变小鼠(红色)光照时间段和黑暗时间段之间活动量的比值。结果用Mean±SEM表示，野生型和Slc7a11突变小鼠的数据使用双侧Student’s检测，n.s.表示>0.05。

2.7 小鼠遗传背景对倒时差的影响

小鼠的遗传背景对小鼠的许多表型有影响，即使相同的C57BL/6分出的亚系C57BL/6J与C57BL/6N在一些表型上也存在差异。那么6J和6N这两个常见亚系之间是否会在生物钟表型上出现差异呢？为了回答这个问题，本研究首先在200 lux条件下，检测了来自不同供应商(江苏集萃药康生物科技股份有限公司、北京维通利华实验动物技术有限公司、斯贝福(苏州)生物技术有限公司)的C57BL/6J或C57BL/6N小鼠对8 h时差的响应。通常8 h的时差反应，需要一周时间适应新的光照周期，如果迅速适应，会被认为生物钟的鲁棒性出现了问题。在比较各亚系及来自不同厂家的小鼠后发现，集萃药康C57BL/6J小鼠在一周内逐渐适应8 h时差(图8A)，其余小鼠都在第1 d就适应了新的光照环境(图8，B～E，附图2)。所以在进行时差反应实验时，需要非常关注小鼠的来源。此外，昼夜节律对外界信号的响应程度也取决于外界信号的高低和内在昼夜节律的强弱，由两者相对大小决定。于是，将光照强度降低至20 lux，再检测集萃药康和维通利华来源的C57BL/6J和C57BL/6N小鼠对6 h时差的响应。C57BL/6J和C57BL/6N都没有在1 d内完全适应时差，集萃药康来源的C57BL/6J和C57BL/6N是在一周左右适应6 h的时差，而维通利华来源的小鼠大部分是在1～2 d时间适应6 h时差(图8，F～I，附图3)。在此基础上，进一步统计小鼠在适应时差过程中的起跳点时间的变化，发现200 lux条件下集萃药康的C57BL/6J小鼠逐渐提前，小鼠的起跳点时间在1 d内提前了8 h，且同一来源的相同遗传背景的小鼠调时差过程中个体差异较大(图8J)。在20 lux条件下，维通利华来源的C57BL/6J和C57BL/6N小鼠的起跳点时间在3 d时间提前了6 h时差，而集萃药康来源的小鼠需要6～7 d以适应新的光照方案，每一组内的波动仍然很大(图8K)。为了更加直观地解读小鼠适应时差的差异，本文进一步计算了小鼠响应时差过程中的PS50 (适应一半时差所需要的时间)。在200 lux条件下，集萃药康来源的C57BL/6J小鼠的PS50明显大于其他小鼠，其他小鼠的PS50之间没有差异(图8L)。集萃药康来源的C57BL/6J和C57BL/6N小鼠PS50明显大于维通利华来源的小鼠，而同一供应商C57BL/6J和C57BL/6N小鼠之间没有明显的差异(图8L)。PS50的差异情况和小鼠适应时差的过程，以及调时差过程中活动起跳点时间的变化趋势一致这些结果说明，不同遗传背景的小鼠及不同厂商的小鼠适应时差的能力不同。因此在选择时差反应实验时，需要严格控制遗传背景，不能使用不同来源厂商供应的小鼠之间进行比较。

图8 不同遗传背景小鼠对时差的响应

A～I：不同遗传背景小鼠时差的跑轮图。GP：集萃药康；CR：维通利华；SPF：斯贝福。J：200 lux光强下适应8 h提前时差的活动起跳点变化曲线。图中阴影部分对应关灯时间段，白色部分对应开灯时间段，结果用Mean±SEM表示，各组小鼠都是6只。K: 20 lux光强下适应6 h提前时差的活动起跳点变化曲线。图中阴影部分对应关灯时间段，白色部分对应开灯时间段，结果用Mean±SEM表示，各组小鼠都是6只。L:小鼠适应时差过程中PS50的统计结果。不同遗传背景的数据使用双侧Student’s检测，*：<0.05，***<0.001。

3 讨论

生物钟领域所研究的科学问题一直以来都是生命科学的热点方向，在2005年发布了125个人类最关注的科学问题，其中就包括机体生物钟是如何同步化的[28]。另一方面，昼夜节律作为一个普遍的生物现象，生物体的许多过程都受到昼夜节律的调控并表现出昼夜振荡[29,30]。机体昼夜节律的破坏，会影响疾病的发生、治疗以及预后[31,32]。因此，寻找调控昼夜节律与外界环境同步化的关键基因，定义昼夜节律失同步与疾病间的关联，已成为目前生物钟领域亟需解答的热点方向。本文以Slc7a11突变小鼠为例，设计了一整套评价昼夜节律的行为学方法，着重讨论了光线对生物钟的影响，目的在于为生物节律相关研究提供可参考的思路和可参借的研究方法。

早在2005年，Corinne等[33]发表了关于小鼠跑轮以及节律相关行为学研究的指南，该指南主要围绕不同光照条件下的小鼠进行行为学检测。本文不仅介绍了昼夜节律行为学检测方法在实际科学研究中的应用，同时提供了一套分析节律相关参数的方法并解释了其生理意义，对检测小鼠昼夜节律相关研究进行了一个较为全面的整理和总结，期望为研究人员在进行节律行为学实验时提供帮助。此外，本文还进一步探究了小鼠品系、遗传背景以及光照强度对生物节律的可能影响，指出不同遗传背景或不同厂商之间小鼠的昼夜节律对外界环境响应都有可能带来很大的差异，能够有效帮助研究人员规避评估小鼠昼夜节律行为学检测中可能遇到的问题，并分析一些可能的原因，如C57BL/6N是突变，为视网膜变性8突变的纯合子，可能影响视网膜感光灵敏度，而C57BL/6J无该突变，因此可能造成光照牵引的差异。此外，饮食等因素也有可能影响昼夜节律的鲁棒性[34]。因此在评价昼夜节律异常研究时，需要注意这些要点，以免带来假阳性或忽略表型。

附录：

附加材料见文章电子版www.chinagene.cn。

附图1 代谢笼和跑轮系统装置图

Supplementary Fig. 1 Installation drawing of metabolism cage and wheel-running system

A：小鼠代谢笼装置图。1：小鼠进食检测装置；2：小鼠饮水检测装置；3：红外感应检测小鼠活动情况装置；4：小鼠消耗氧气以及产生二氧化碳检测装置；5：在使用代谢笼记录之前，首先对代谢笼进行气体平衡；6、7：将记录的小鼠进食、饮水情况传递给计算机；8：整合小鼠活动代谢数据传递至计算机。B：小鼠跑轮装置图。1：光控开关，可以设置不同的开关灯时间，光照周期；2：光照强度调节开关，每一个记录仓的灯光对应一个光强开关；3：机械打点感应器，连接在带有跑轮的笼盒上，实时记录滚轮的转动；4：记录仓，每只小鼠单独放置于记录仓中，保证小鼠之间不会互相干扰；5：带有滚轮的笼盒；6：数据集中处理装置，同一排的七个打点器共同连接于此，并将数据传递给采集盒；7：数据采集盒，可以同时整合多通道的跑轮数据，并传递给计算机；8、9：Clocklab软件，可以实时查看各个记录通道的小鼠活动情况；10：MATLAB软件，一般通过局域网将动物房Clocklab软件记录的数据共享至实验室，通过该软件可以实时查看小鼠的活动情况，以及计算小鼠的活动周期、起跳点等参数。

附图2 200 lux下不同遗传背景小鼠倒时差跑轮图

Supplementary Fig. 2 Wheel-running of mice with different genetic background to jet lag at 200 lux

附图3 20 lux下不同遗传背景小鼠倒时差跑轮图

Supplementary Fig. 3 Wheel-running of mice with different genetic background to jet lag at 20 lux

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Rapid assessment of circadian behavior in mice

Yizhun Zeng, Tao Zhang, Ying Xu

Circadian rhythms have a cycle length of about 24 hours, i.e. a 24-hour internal clock. In order to adapt to the periodic changes of the circadian environment, almost all organisms on the earth, including algae, bacteria, plants, animals, etc., have evolved a special system—the circadian clock. It helps organisms to adapt to the daily changes in the environment and maintains the physiological process and the behavior in synchronization with the environment changes. Circadian rhythms are composed of an intracellular feedback loop that drives the expression of molecular components and their constitutive protein products to oscillate over a period of about 24 hours. Almost every aspect of the body's functions, including behavior and physiology, is regulated by the circadian clock, and shows obvious daily rhythms, such as sleep and wakefulness, alertness, body temperature fluctuations, urinary system, hormone secretion, immune regulation, and cytokine release. Circadian factors are also increasingly recognized for potentially affecting the occurrence, progression, treatment, and prognosis of a variety of diseases. This paper discusses several methods for measuring circadian behavior disorders in mice for different purposes, and shares experimental operations and analysis ideas, including the use of metabolism cage, wheel running activity, jet lag, lengthened light, bones photoperiod, as well as the T7-cycle. In addition, this paper also studies the possible reasons for variations caused by genetic backgrounds and light conditions. Given these methods, researchers can choose appropriate experiments to evaluate the influence of genetic factors, environmental factors or diseases on circadian behavior.

circadian rhythm;metabolism cage; wheel running; measuring method

2022-02-23;

2022-03-30;

2022-04-08

国家自然科学基金项目(编号：31630091，32100931)资助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31630091, 32100931)]

曾义准，本科，专业方向：细胞生物学。E-mail: 20194250014@stu.suda.edu.cn

徐璎，博士，教授，研究方向：生物钟。E-mail: yingxu@suda.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-051

(责任编委: 陈帅)