光动力抗菌治疗骨髓炎的研究进展

赵建喜，尹秀娟，方子源，杜梓硕，朱林，赵占娟

(1.河北大学附属医院 放射科,河北 保定 071002； 2.河北大学 临床医学院，河北 保定 071002； 3.河北大学 基础医学院，河北 保定 071002；4.河北医科大学 基础医学院，河北 石家庄 050000)

骨髓炎是由细菌感染引起的深部组织炎症，持续感染会导致骨组织的溶解和坏死.急性骨髓炎若不及时治疗很容易进展为慢性骨髓炎，慢性骨髓炎的治愈率极低，是医学上公认的顽疾[1]，病情严重的患者还会面临截肢的风险，已成为临床骨科最严重的疾病之一[2].目前骨髓炎的治疗方法主要有手术清创治疗和局部及全身使用抗生素治疗等[3].手术清创可以快速、准确地去除骨髓腔内的炎症，但很难彻底清除骨髓腔内残留的致病菌[4]；术后患者的肢体功能也会受到一定的损害，降低了患者的生活质量[5].早期全身使用抗生素可以有效治疗骨髓炎；慢性期全身及局部使用抗生素在一定程度上也能抑制骨髓腔内的致病菌，但长期大剂量地使用抗生素会产生全身性副作用，且随着耐药性菌株的不断出现，抗生素治疗骨髓炎也面临着巨大挑战[6].因此，探寻疗效好、副作用少、有效减少疾病复发的新方法是临床医生需要迫切解决的问题.光动力抗菌化学疗法(photodynamic antimicrobial chemotherapy，PACT)因毒副作用小，对耐药菌不会产生耐药性和无创性等优点[7]而逐渐引起人们的关注.本文将结合新近研究成果，阐述PACT在骨髓炎治疗领域的研究进展.

1 骨髓炎的致病菌及难愈的因素

1.1 骨髓炎的致病菌

骨髓炎的常见致病菌是金黄色葡萄球菌，其次是铜绿假单胞菌和溶血性链球菌等[8].最新研究表明[9]，骨髓炎中革兰阴性菌感染率逐渐上升，而革兰阳性菌的感染率较之前有所下降；Shipitsyna等[10]也发现，不管是革兰阳性菌还是革兰阴性菌，耐药菌的分离率都很高.耐药菌的广泛存在导致单纯使用抗生素治愈骨髓炎的可能性越来越低，同时也为骨髓炎清创术后常规使用抗生素治疗增加了难度.

1.2 骨髓炎难愈的因素

1.2.1 死骨的形成

骨髓炎形成的坏死骨组织无血液供应，药物治疗主要依靠单纯的物理渗透进入组织.药物通过物理渗透能渗入微小死骨的中心，但大块死骨中心却很难通过渗透达到灭菌所需的药物浓度[11]，即使联合应用多种抗生素大剂量治疗骨髓炎，治疗效果仍然不佳，还会导致全身性副作用及耐药菌株的出现[12].

1.2.2 细菌耐药性的产生

20世纪60年代首次发现医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcusaureus，MRSA)[13]，到20世纪90年代出现社区获得性MRSA[14]，表明耐药菌已在社区中广泛存在.由于抗生素的广泛使用，使越来越多的致病菌产生耐药性，甚至导致全球范围内多重耐药菌(multidrug resistante，MDR)出现，由MDR导致的骨感染性疾病的复发率和致残率也在逐年上升[15]；据估计，到2050 年，每年可能有近1 000 万人死于耐药菌株感染[16].MRSA是骨髓炎常见且最具耐药性的致病菌之一，它能够通过改变基因，如改变细菌细胞壁的主要成分肽聚糖的合成来获得耐药性[17].MRSA的广泛存在加大了骨髓炎的治疗难度[18].

1.2.3 细菌生物膜的形成

细菌生物膜的形成是骨髓炎难治愈的另一主要原因[19].细菌生物膜保护细菌免受周围环境的伤害[20]，阻止抗生素和宿主免疫细胞进入细菌生物膜群落[21]，使细菌对抗生素产生耐药性，从而导致多重耐药、广泛耐药和完全耐药细菌的出现[22].骨组织表面形成的细菌生物膜会导致骨组织的持续、反复的慢性感染.

1.2.4 细菌L型产生

某些不利条件会导致细菌的细胞壁缺陷，这种细胞壁缺陷的细菌称为细菌 L 型.细胞壁的缺陷使其在生物学特性、致病性及形态等方面与之前的细菌明显不同[23].细胞壁上的抗原部分缺失，造成细菌 L 型的抗原性减弱，从而能够逃避机体免疫系统的攻击，使其在体内可以长期留存，一旦条件合适，L 型又可以转变为原细菌型，使疾病复发，迁延难愈.陈晓东等[24]对骨髓炎患者的标本进行检测，发现细菌L型的检出率为51%，说明骨髓炎的发生、发展与细菌L型的产生、感染密切相关.

2 PACT治疗骨髓炎的研究

目前，骨髓炎治疗中需要迫切解决的问题是寻找有效抗菌且不易产生耐药性的方法.PACT因其不易产生耐药性及抗菌谱广等优势已成为目前最有前景的新型抗耐药菌的治疗方式之一[7]，被人们誉为“抗生素时代的终结者”[25].近年来，随着新型光敏剂的问世、激光光源的改进及实验条件的改善，研究人员对PACT在治疗体内感染方面进行了相关临床研究，并取得了较好的临床效果[26].PACT是通过激光照射光敏剂使其产生活性氧化合物，并利用产生的活性氧化合物对病原微生物进行灭活的一种抗菌方法[27].骨髓炎是深部组织的感染性炎症，PACT治疗骨髓炎主要是将光敏剂溶液全身注射(腹腔或静脉注射)或局部注射到感染的骨髓腔[28-30]，暗孵育一段时间，光敏剂能够随血液循环特异性聚集于细菌感染部位，然后用激光照射感染部位，会产生大量活性氧及自由基，这些活性氧化合物能够灭活骨髓腔内的细菌，从而达到治疗骨髓炎的目的[31-33].

2.1 PACT治疗骨髓炎的基本要素

PACT治疗骨髓炎是由光敏剂、组织氧浓度和光源3方面的因素相互配合发挥治疗效应的[34].

2.1.1 光敏剂

光敏剂在特定波长的激发光照射下产生的活性氧化合物能精准、靶向作用于细胞，是PACT治疗的基础.近几十年光敏剂的研究取得了一定的进展.第1代光敏剂包括血卟啉衍生物(HpD)[35]和光卟啉photofrin[36]等，特点是在体内停留时间长，使其激活所需激光的穿透力较差(< 0.5 cm)，限制了在深部组织中的应用.第2代光敏剂大致可分为5类: 卟啉衍生物[37]、单氢化卟啉、酞菁、叶绿素a降解产物和衍生物[38]及其他光敏剂[39].与第1代光敏剂相比，第2代光敏剂在可见光区具有更强的吸收性、更好的组织穿透力及更高的活性氧产生率.第3代光敏剂是将一些具有生物学特性或具有分子识别功能的化学物质加入到传统光敏剂的结构中，进一步提高了对病变组织的选择性，减少了光动力治疗过程中的不良反应，具有较高的靶向功能[40].例如，Jia[41]通过引入原卟啉IX(PpIX)和季铵盐基团(QAS)，制备了水溶性好、毒副作用低的光敏剂CPs，CPs介导的PACT能有效杀灭耐药的大肠杆菌和耐药的金黄色葡萄球菌，解决了传统光敏剂由QAS 导致的活性氧效率低的问题.目前，临床所使用的第3代光敏剂仍然有限，而且它所介导的PACT疗效在很大程度上取决于病变区域内激光剂量和活性氧的产生效率，此外在临床应用过程中的一些不良反应也不容被忽视.目前，第4代新型的光敏剂正逐渐被开发[42]，如基于聚集诱导发光(AIE)的光敏剂，主要包括噻吩(TP)、二苯乙烯基蒽(DSA)和四苯基吡嗪(TPP)等.与第3代光敏剂相比，基于AIE的光敏剂具有优异的光稳定性、端基可修饰性和聚集态的强荧光特性，其未来的临床应用价值已经引起人们的广泛关注.

目前用于PACT治疗骨髓炎的光敏剂多为阳离子光敏剂，研究表明某些阳离子光敏剂如亚甲蓝(MB)[43]、甲苯胺蓝(TBO)等吩噻嗪衍生物、阳离子卟啉类和酞菁类(Pc)[44]在PACT治疗细菌感染方面比中性光敏剂[45]或负电荷光敏剂[46]具有更好的抑菌效果；其他一些用阳离子基团修饰的、对细菌具有特定靶向性的光敏剂包括氟化硼络合二吡咯甲川(BODIPY)、环萘酮或二萘嵌苯衍生物等[47-48]，如Lu等[30]合成的含有光敏剂的细菌炎症特异性多功能制剂牛血清白蛋白-二氧化锰-泛素-吲哚菁绿-庆大霉素(BMUIG)，对骨髓炎的致病菌有特异的靶向性，并且对大鼠胫骨骨髓炎有明显的治疗效果.

2.1.2 组织氧浓度

氧是PACT治疗过程中的重要组成部分，组织中的氧是光化学反应的底物，组织氧浓度越高，越能促进光化学反应，提高PACT的治疗效果.光化学反应中产生的毒性单线态氧对光敏剂有漂白作用，可导致光敏剂被消耗，影响PACT治疗效果，如果组织氧浓度高则可在一定程度上减弱光漂白作用，增强PACT的治疗效果.Liu等[49]研发了一种光敏剂杂化的纳米平台(R-MnO2-FBP)，它能够被特异性地导入癌细胞，利用过氧化氢(H2O2)在酸性的环境释放大量氧气的特点，实现了氧自供过程的双模式(磁共振成像/荧光成像)监测，进一步证实了通过增加氧含量能够提高光动力诊断及治疗的效果.骨髓炎的炎症微环境类似于肿瘤环境，以缺氧、酸化和H2O2水平高为特征[50].因此，Lu等[30]合成的光敏剂在酸性条件下与局部产生的H2O2反应产生氧气，通过提高组织内的氧浓度及联合使用抗生素，明显增强了PACT治疗大鼠胫骨骨髓炎的效果.

2.1.3 光源

光源的波长及能量密度对PACT治疗骨髓炎的效果有重要影响.光波长不同则对组织的穿透力不同；光能量密度不同，导致的治疗效果也不同.光的穿透深度与组织密度和厚度有关，临床应用中应对不同的组织选择不同波长的激光进行照射.与紫外光和可见光相比，近红外光表现出更强的组织穿透力.Salehpour等[51-52]用波长为810 nm的激光对雄性大鼠进行照射，结果显示，该波长的光对颅骨的透过率为(51.41±2.12)%，对头皮和头颅的透过率为(39.9±0.40)%;改用660 nm的激光进行照射，只有5.8% 的光可以穿过头皮和头盖骨到达脑实质表面.Nötzli[53]测定632.8 nm的激光在牛股骨和胫骨的最大穿透深度，发现激光的最大穿透深度在皮质骨为(2.9±0.2)mm，在1 mm软骨处为(3.5±0.3)mm，在骨小梁为(3.5±0.2)mm.这些结果都表明近红外光有足够强的穿透力，可作为PACT治疗骨髓炎的光源.

2.2 PACT治疗骨髓炎耐药菌及细菌生物膜的体外研究

2.2.1 PACT对耐药菌的体外治疗效果

PACT 对耐药菌有显著的灭菌优势，对周围正常组织具有很低的暗毒性,并且不易使细菌产生耐药性[54-56].Hajim等[57]从临床分离出8株MRSA，用质量浓度为50 μg/mL的TBO作为光敏剂，用632.8 nm的激光对实验菌株照射15 min， 8株MRSA均被灭活，表明TBO介导的PACT能够灭活对某些抗生素不敏感的MRSA.Malá等[58]将MRSA和肺炎克雷伯杆菌分别与光敏剂四(1-甲基吡啶嗡-4-基)卟吩对甲苯磺酸盐(TMPyP)暗孵育45 min和5 h，用总能量为10 J/cm2和20 J/cm2的LED光源(414 nm)分别照射以上2种细菌，之后将其放入含有银纳米颗粒AgNPs的微生物培养基中，比较不同浓度的TMPyP对细菌的灭活效果. 实验结果表明，PACT能够较好地灭活MRSA和肺炎克雷伯杆菌，TMPyP的灭菌浓度分别为1.56～25 μmol/mL和1.56～50 μmol/mL,并且还发现TMPyP和AgNPs能够起到协同的灭菌效果.Xu等[59]用不同浓度(0.98～500 μmol/mL)的赖氨酸-卟啉结合物(4i)作为光敏剂，用650 nm的激光体外照射临床分离的MRSA、铜绿假单胞菌及大肠杆菌30 min，来探究4i的有效抑菌浓度及对3种致病菌的抑菌效果.结果表明光敏剂4i对MRSA、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的有效抑菌浓度为3.91～62.50 μmol/mL，并且对3种菌株均具有较强的抗菌作用.随着对PACT的深入研究，发现PACT不仅对敏感的革兰阴性菌有效，对广泛耐药的阴性菌同样有很好的治疗效果.Carcez等[60]用浓度为100 μmol/mL的MB溶液作为光敏剂，用660 nm的激光照射耐药大肠杆菌悬液3 min，对照组在耐药大肠杆菌悬液中加入青霉素，在30 ℃下孵育60 min，通过高光谱共聚焦显微镜比较大肠杆菌细胞壁结构的损伤情况，发现PACT能够破坏耐药大肠杆菌的细胞壁，进而引起耐药大肠杆菌的灭活.

2.2.2 PACT 对生物膜内细菌的灭活效果

骨髓炎感染部位形成的生物膜能够保护生物膜内的细菌免受外界环境的伤害，即使用高浓度的抗生素也难以清除，使得骨髓炎的治疗更加困难.目前，在PACT治疗细菌生物膜方面也进行了相关实验研究.Rosa等[61]在致密骨和松质骨标本上建立标准金黄色葡萄球菌生物膜模型，利用MB染料介导的PACT进行治疗.与对照组相比，PACT治疗组致密骨和松质骨中金黄色葡萄球菌生物膜的数量均显著减少(抑菌率>95%)；与致密骨相比，松质骨内的生物膜数量的减少幅度最大.说明MB染料介导的PACT能够有效地灭活致密骨及松质骨中形成的金黄色葡萄球菌生物膜，其中以松质骨生物膜的灭菌效果最好，推测可能与激光的组织穿透力有关.Bisland等[29]在克氏针上建立金黄色葡萄球菌生物膜模型，并将其分别浸入浓度均为1 μmol/mL的MB和ALA溶液中，分别暗孵育4 h和30 min，用(640±40)nm的LED光进行照射治疗，PACT治疗频率为1次/d，每次光照射的能量密度分别为5 J/cm2和1 J/cm2，共治疗4 d，通过生物发光信号的强弱来监测治疗效果.与对照组相比，MB或氨基乙酰丙酸盐酸盐(ALA)介导的PACT治疗组生物发光信号明显低于对照组，表明光敏剂MB或ALA介导的PACT疗法能够明显抑制生物膜内的细菌.Banerjee等[62]建立了多药耐药大肠杆菌生物膜、MRSA生物膜及混合细菌生物膜.用浓度为50 μmol/L 的核黄素作为光敏剂，用波长为450 nm的LED光照射3种不同的生物膜，用肉汤稀释法和结晶紫测定抗菌效果及生物被膜活性，评价PACT的灭活效果.抗菌实验表明，光照核黄素对各种细菌及其混合培养均有杀菌作用，大肠杆菌的抗药性略高于金黄色葡萄球菌.结晶紫实验表明，PACT对单一生物膜和混合生物膜均表现出灭菌性，但对混合菌种生物膜的灭菌效果比单一菌种生物膜的灭菌效果稍差.上述实验均表明PACT在治疗抗生素难以清除的细菌生物膜方面具有很大的潜在应用，为慢性难愈性骨髓炎的治疗提供了新的方向.

2.3 PACT治疗骨髓炎的体内研究

2.3.1 PACT治疗骨髓炎的动物实验研究

Bisland等[28]首次将PACT作为治疗骨髓炎的一种替代疗法，使用克氏针建立生物发光菌株金黄色葡萄球菌生物膜模型，并将其植入大鼠胫骨骨髓腔内制备成大鼠胫骨骨髓炎模型.植入10 d后，腹腔注射光敏剂ALA(300 mg/kg)，暗育4 h后用激光((635±10)nm；75 J/cm2)进行照射.与未接受光照射的对侧胫骨相比，急性骨髓炎PACT治疗后24 h的生物发光百分率出现显著下降，治疗48 h后生物发光消失.但是治疗2周后，所有病例的生物发光明显增强，表明金黄色葡萄球菌感染复发，而且感染复发通常发生在远离初始感染部位的区域，但在感染的胫骨中分离的存活金黄色葡萄球菌菌落的实际数量仍然明显少于对照组，表明ALA介导的PACT对骨髓炎中的金黄色葡萄球菌生物膜有一定的灭菌效果，但PACT对邻近软组织的损伤问题有待进一步解决.

Dosreis等[63]用金黄色葡萄球菌感染大鼠，建立大鼠胫骨骨缺损的慢性骨髓炎模型，用甲苯胺蓝(5 μg/mL)作为光敏剂，并用二极管激光器(40 mW，10 J/cm2)照射5 min.治疗后立即进行检测，发现PACT组细菌减少率为97.4%；治疗30 d后，细菌减少率超过99.9%；组织学观察到PACT治疗组有大量的成骨细胞形成，未见明显骨缺损及微脓肿形成.实验证实使用甲苯胺蓝介导的PACT能有效减少金黄色葡萄球菌的数量，并有利于骨的修复.Bisland等[29]将MRSA注入大鼠胫骨建立骨髓炎模型，在MRSA感染后的48 h，将浓度为560 μmol/L的Na-Phde a溶液注射到胫骨骨髓炎模型中，暗孵育60 min后，使用半导体激光器(670 nm，125 mW)照射10 min，结果显示Na-Phde a 介导的PACT可显著预防腿部肿胀.进一步研究发现，PACT组的骨破坏不仅在组织学上受到抑制，而且在放射学上也受到抑制，说明PACT不仅能够抑制骨髓炎患者髓腔内的致病菌，还能促进感染骨组织的后期修复，提示Na-Phde a介导的PACT是一种具有潜在临床应用价值的骨髓炎治疗方法.

Lu等[30]用金黄色葡萄球菌制备大鼠胫骨急性骨髓炎模型，并将0.2 mL的具有特异靶向性的复合物BMUIG(1.0 μmol/L)注入大鼠体内并用808 nm的激光对感染部位照射15 min，通过基于吲哚菁绿(ICG)的光声成像和基于Mn2+的T1磁共振成像，准确、快速地识别感染区域.由于骨髓炎的炎症微环境类似于以缺氧、酸化和高水平H2O2为特征的肿瘤环境[50]，所以在酸性炎症条件下，BMUIG中的二氧化锰与局部产生的H2O2反应，持续生成氧气，以增强光动力疗法.实验结果表明，BMUIG能够对骨髓炎进行准确无创的诊断和有效治疗，并且与小剂量庆大霉素(5 mg/kg)联合应用还能够发挥协同作用，为常见骨感染性疾病提供了一种良好的治疗策略.

马金超等[64]建立新西兰大白兔慢性胫骨骨髓炎模型，并将其分成空白组、对照组和实验组；其中空白组胫骨开窗清创后不予处理，对照组胫骨开窗清创后在感染的胫骨骨髓腔内填入万古霉素-聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥进行治疗，实验组胫骨开窗清创后向髓腔内注入新型抗菌活性氨基酸卟啉光敏剂4i，并将波长为(635±10) nm的光纤导入骨髓腔进行30 min的照射.X线检查结果表明，随着时间的延长，空白组的骨髓炎症逐渐加重，治疗后实验组及对照组骨质破坏逐渐减少，骨质缺损逐渐愈合，实验组与对照组术后不同时间点的表现无差异(P>0.05)；细菌培养结果表明随着时间的延长，空白组细菌阳性率无明显变化，实验组及对照组细菌阳性率逐渐下降，且实验组与对照组术后不同时间点的细菌阳性率比较差异无显著性意义(P>0.05)，进一步证明了PACT作为一种治疗骨髓炎的新方法，可有效阻止骨髓炎的病程进展.

2.3.2 PACT治疗骨髓炎的临床应用

糖尿病相关的神经性病变可导致浅表和内部组织感染及溃疡的形成，并存在截肢的潜在风险[65].糖尿病患者大脚趾截肢最常见的原因是软组织溃疡(39%)、伴有骨髓炎合并溃疡(32%)及其他损伤(12%)等，11% 的患者在第1次截肢手术后10个月会再次截肢[66]，因此，需迫切寻求一种能彻底治愈糖尿病足部感染，使患者免于截肢的治疗方法.

Tardivo等[33]首次用PACT治疗糖尿病患者的足部骨感染：主要对2例即将进行足部截肢的糖尿病骨髓炎患者进行PACT治疗，分别将光敏剂吩噻嗪药物溶液(亚甲基蓝和甲苯胺蓝1∶1体积比混合物) 和10%的丙二醇混合物经皮肤窦道注入2个患者的骨感染处，5 min后，将He-Ne激光(632 nm，5 mW)的光纤引入窦道，直达骨髓炎感染部位，进行10 min的激光照射，同时用非相干多色光源(750 nm，100 mW)对外部感染的软组织进行照射，治疗结束后对患者进行临床随访和影像学检查.X光片检查结果显示2个患者的骨缺损均愈合，骨的结构明显改善，结果表明，PACT能够治愈这些即将进行足部截肢的糖尿病患者，使患者免于截肢，提高了患者的生活质量.Tardivo等[67]随后又进行了另一项临床研究，将34名达到骨髓炎Wagner量表3级标准的糖尿病足骨髓炎患者分为PACT组(n=18)和对照组(n=16)， PACT组将0.5 mL的吩噻嗪药物溶液注入感染部位，用波长为640 nm的LED光对感染部位进行10 min的照射；对照组患者进行临床常规治疗.治疗结束后，PACT组中有17名患者骨感染明显愈合，只有1 人截肢，而对照组的16 名患者最终都选择截肢手术，PACT组的截肢率是对照组的0.029倍，并且接受PACT治疗的17例患者2年后无复发.结果证实，PACT在治疗糖尿病患者足部感染方面具有非常好的疗效.PACT能够减少糖尿病患者的截肢率，为糖尿病足骨髓炎的患者提供了较好的治疗方案.Tardivo等[68]在前期研究的基础上又将糖尿病足骨髓炎患者分为2组: 一组在PACT治疗前进行清创，另一组在PACT治疗前不进行清创，用波长为640 nm的LED光对感染部位进行10 min的照射.结果表明，2组PACT治疗糖尿病足骨髓炎的有效率均为100%，随访1年无复发，而进行清创的PACT组治愈时间较未进行清创的PACT组短 (p=0.036)，结果证实，PACT是一种安全有效、简单和经济的治疗糖尿病足骨髓炎的方法，在治疗骨科感染方面有很大的优势，并且效果也很理想.骨科医生可以考虑将PACT作为临床治疗骨髓炎的可行性方法，用来治疗难治性、复发性骨髓炎.

3 前景和展望

耐药菌的不断出现，使PACT的应用受到越来越多的关注.PACT因损伤小、重复性强、副作用小及能有效防止耐药菌产生等优点，有望成为一种治疗耐药菌所致感染的新方法及耐药菌所致骨髓炎的新型抗菌手段.PACT将为难治性骨髓炎患者、年老体弱及伴有严重内科疾病而无法使用抗生素和无法进行手术的患者带来福音.

PACT治疗骨髓炎的方法目前还未完全应用于临床，但与抗生素治疗骨髓炎相比，PACT在治疗耐药菌株造成的骨感染实验研究中已经表现出明显的优点：短时间内即可清除感染的微生物，且不会使微生物产生耐药性；不会损伤邻近的宿主组织，对正常菌群影响很小；可以增加创面胶原蛋白的沉积，加快创面的愈合速度[69]；可避免某些感染并发症的发生、发展.

PACT 在治疗骨感染方面有其明显的优势，但同样还需要克服一些应用限制：1)针对不同的耐药微生物的靶向新型光敏剂需进一步研发；2)光敏剂在体应用的精准靶向性问题；3)光敏剂对光源的最适波段的选择及在体光的传送问题；4)光敏剂在体的代谢和光漂白对 PACT的影响；5)宿主组织对光及光敏剂的过敏性问题.

PACT的研究进展使得其在难愈性感染疾病中的应用越来越广泛，未来PACT作为一种新型安全疗法，在临床治疗难治性、复发性骨髓炎方面将大放异彩.