新型肝动脉栓塞微球制剂的制备

宋鹏锦，韩啸，孙彩凤，孙海川，曹晓亮，胡连栋

(1.河北大学 河北省药物质量分析控制重点实验室，药学院，河北 保定 071002；2.保定市第一中心医院 医务处，河北 保定 071000；3.保定市第一医院 介入医学科，河北 保定 071000)

据2020年全球癌症统计数据显示[1]，原发性肝癌是第三大癌症死亡原因，约有8.3×105例死亡.肝移植和手术切除是肝癌患者治疗的主要选择[2-3].大于3 cm肿瘤切除难度大，同时考虑到肿瘤的大小、数量和分布，手术切除并非适用所有患者[4].然而，接受了手术切除的患者中，术后5年复发率仍高达60%[5-6].

肝动脉灌注化疗栓塞(TACE)是一种临床上可接受的技术[7]，其主要原理是依次将化疗药物和栓塞材料注入肿瘤供血动脉内，进行化疗栓塞.TACE优势如下：1)通过一次性大剂量灌注化疗药物，局部靶向肿瘤药物浓度得到提高，靶向化疗药物接触肿瘤组织的时间延长，患者的生存质量显著改善；2)选择性闭塞病变血管，造成肿瘤组织供血不足和缺氧，达到治疗目的[8].TACE已成为治疗中晚期肝癌的首选方法[9].

现阶段常见的栓塞材料有明胶海绵、碘化油乳剂、载药微球、聚乙烯醇(PVA)颗粒等[10].随着技术手段及栓塞材料的革新，相较于传统的灌注化疗和碘化油栓塞，载药栓塞微球技术治疗肝癌已成为近年来临床研究的热点.载药栓塞微球技术具有药物灌注化疗和栓塞的双重效果，能保证肿瘤区域足够药物浓度，降低全身血药浓度水平，将原本每月1次的治疗周期延长至3个月，比传统TACE安全性更高[11].新型载药微球产品能够大幅度降低治疗成本，拓宽治疗范围，受到专家的广为期待.

姜黄素是一种天然的酚类色素[12].已有临床数据和大量研究表明，姜黄素可通过多种机制影响癌细胞生长和凋亡，在多种恶性肿瘤治疗方面发挥作用[13-15]，包括肺癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌和卵巢癌等.

本文以PVA为载体，采用反相乳化交联法制备了姜黄素载药微球.确定最佳制备条件后，对微球的结构和理化性质进行了研究.建立了兔VX2肝癌模型[16]，同时对比分析了姜黄素栓塞微球对肝脏肿瘤的治疗效果和安全性.

1 仪器与试剂

聚乙烯醇(PVA 1788)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；失水山梨醇单油酸酯(span 80)购自国药集团化学试剂有限公司；聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯(Tween 80)购自天津市天大化工实验厂；姜黄素购自国药集团化学试剂有限公司；液体石蜡购自天津市大茂化学试剂厂；盐酸购自天津市科密欧化学试剂有限公司；T6紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限责任公司；BT-9300ST激光粒度分布仪购自丹东百特仪器有限公司；JSM-7500冷场发射扫描电子显微镜购自日本电子株式会社；FJ-200 高速剪切匀质机购自上海标本模型厂；UNIQFD20C DSA血管造影介入治疗系统购自荷兰飞利浦公司；FV3000激光共聚焦扫描显微镜购自奥林巴斯(中国)有限公司.

2 方法

2.1 PVA栓塞微球的制备

称取PVA溶解在去离子水中，制得PVA溶液，冷却至室温.将表面活性剂Span 80加入100 mL液体石蜡中搅拌，形成油相.取PVA溶液和盐酸溶液混合，加热并快速搅拌，形成水相.将水相加入油相中，搅拌(300 r/min)20 min，得到均匀的W/O型乳液.随后加入交联剂戊二醛，使其与PVA发生交联反应.持续搅拌1 h，过滤，清洗，干燥，得白色粉末状微球.

2.2 微球的形貌和粒度

使用碳导电双面胶带将微球固定在金属桩上，真空下喷金，10 kV激发电压下使用扫描电子显微镜观察微球表面形态的变化.

将适量栓塞微球放入投料池中，启动超声循环，直至遮光率达到 10%～15%时停止，接着超声循环约3 min，用激光粒度分布仪测量载药微球粒度分布范围，对实验数据进行整理记录和计算，用跨距(Span)评估栓塞微球粒径的均匀性.

式中，D90、D50 和D10分别代表 90%、50%和 10%栓塞微球最大粒径小于该值所示粒径.

2.3 生物安全性测试

取最优化微球进行急性溶血、细胞凋亡和体外细胞毒性实验以证明微球的安全性.

2.3.1 急性溶血实验

取 10 mL玻璃试管 7 支，每支试管中加入 2.5 mL体积分数2%红细胞混悬液，进行编号：1号管加2.5 mL水作阳性对照组，2号管加2.5 mL生理盐水作阴性对照组，将0.5 mL质量浓度为12.5、25、50、100、150 mg/mL的微球分别加入到含2 mL生理盐水的3至7号管中.

2.3.2 细胞凋亡

采用激光共聚焦扫描显微镜观测MGC-803细胞在姜黄素药物诱导下的凋亡过程.通过荧光双染法，对处于各个凋亡时期的肿瘤细胞进行考察.荧光双染中用到的DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐)属于一种荧光染料，将癌细胞细胞核染成蓝色；Alexa Fluro®488是一种荧光探针，将细胞膜和细胞质染成绿色[17].

2.3.3 体外细胞毒性实验

选取小鼠 L929 纤维细胞，设置微球组、阴性对照组和阳性对照组.将小鼠 L929细胞稀释至 5×104/mL，在无菌孔板中以 90 μL/孔加入细胞悬液，培养 12 h.微球组分别加入 1、3、 6.25、12.5、25、50、100、150 mg/mL栓塞微球；阴性对照组加入 100 μL 细胞培养基；阳性对照组加入 100 mL体积分数5% DMSO 溶液，培养 48 h，置显微镜下观察不同组的细胞形态.每孔加入 10 μL 噻唑蓝(MTT) 溶液，继续培养 4 h，490 nm处测定吸光值，计算细胞相对增殖率(RGR)，将 RGR值转化成 6 级，评定材料毒性，见表1.

以空白对照孔调零，按照公式计算各培养孔RGR.

式中,RGR为相对增殖率，%；X1为实验样品组的吸光度；X2为阴性对照组吸光度；X0为空白对照组吸光度.

表1 细胞毒性反应分级

2.4 药效学研究

2.4.1 VX2肝癌动物模型的建立

家兔术前禁食12 h，禁水4 h，操作见图1.1)将VX2肿瘤细胞移植于兔后腿肌肉外侧，植入1个月后可见实质性肿块，即荷瘤兔；2)处死荷瘤兔，在无菌条件下分离出VX2肿瘤，制成2 mm×2 mm×3 mm的肿瘤组织，然后将碎片储存在生理盐水中；3)进行兔腹部正中切口手术，将VX2肿瘤接种于肝左叶候选肝区，用明胶覆盖穿刺部位，左肝叶置换入腹腔，缝合切口，表面涂抹红霉素软膏；4)所有兔在VX2肿瘤植入后肌注硫酸庆大霉素(8×104U/d，2 mL)3 d.肿瘤在兔子的肝脏中生长14 d.

图1 包埋法建立肝癌模型Fig.1 Establishment of hepatocellular carcinoma model

2.4.2 TACE治疗

对植入VX2肝肿瘤的兔进行TACE治疗.将15只实验兔随机分为3组(姜黄素载药微球栓塞组、空白微球栓塞组和单纯造影组)，每组5只.载药组和空白组做全麻处理，对每只家兔的下肢动脉进行解剖，在DSA血管造影介入治疗系统引导下，将导管导丝从股动脉移至肝肿瘤供血动脉，然后将栓塞微球分别注入家兔的供血动脉.缝合兔腿动脉，肌注硫酸庆大霉素(8×104U/d)3 d，常规标准饲料喂养.单纯造影组在完成造影后直接撤出导管，缝合后采用与栓塞组相同的术后管理方式.

2.4.3 CT灌注扫描

所有接受TACE治疗的实验兔分别于术后14、21 d进行CT扫描，与术前1周的CT影像数据对比，确认成瘤情况，操作见图2.依据CT影像测量肿瘤长宽高，计算体积：V=1/2×ab2，其中，a为肿瘤最长直径，b为肿瘤最短直径.

图2 实验兔 CT 检查Fig.2 CT examination of experimental rabbits

2.4.4 生存期观察

为了评估姜黄素载药微球对肿瘤组织影响，动脉栓塞给药后，观察各组动物生长情况，记录动物死亡数和平均生存时间，计算生命延长率(ILS).

对比各组实验动物平均生存时间并做出生存曲线，用生存曲线分析动物存活率.

2.4.5 组织学评估

将TACE术后的3组肝癌兔解剖，取出肝癌组织后进行H&E染色，置荧光显微镜下进行观察，评价栓塞术后肝组织是否发生病理学改变.实验过程中均按照动物伦理学标准对动物进行处置.

2.5 统计学方法

数据结果采用 SPSS 10.0 软件进行统计分析和处理，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有显著性意义.

3 结果

3.1 微观形态

制备的微球外观圆整、光滑，实验结果见图3a.激光粒度分布仪测得PVA载药微球的平均粒径为94.19 μm，粒径分布在45～200 μm的微球为84.67%.D10为 39.22 μm、D50为 89.85 μm、D90为158.3 μm，计算得跨距为1.325，实验结果见图3b.

图3 PVA微球的扫描电镜照片(a)和粒径分布(b)Fig.3 Scanning electron microscope of PVA microspheres(a) and size distribution of PVA microspheres(b)

3.2 载药栓塞微球的安全性评价结果

3.2.1 急性溶血实验结果

实验结果见图4(从左至右分别为1～7号管).1号管(阳性对照组)中红细胞破裂(4 h)，溶液呈现红色.2号管(阴性对照组)与含有微球样品的3～7号管中上清液均为无色透明，底部有红细胞沉降.

取微球样品(150 mg/mL)及阴性和阳性对照组样品分别置于显微镜下观察.实验结果见图5.微球组与阴性对照组中的红细胞形态完整，分散性良好，无聚集现象，而阳性对照组中的细胞破碎.实验表明微球安全性较好，不会引起溶血现象.

图4 溶血实验结果(室温放置4 h，从左至右1～7号管)Fig.4 Result of hemolysis test( for 4 h，tube 1—7 from left to right)

图5 溶血实验结果的光学显微镜照片Fig.5 Optical microscope images of hemolysis test

3.2.2 细胞凋亡结果

荧光双染后，激光共聚焦扫描显微镜下的观察结果见图6.DAPI细胞核染色显示，实验组活细胞数量减少，微球粒径大于细胞粒径，难以被细胞摄取，载药微球可释放姜黄素将细胞杀死；香豆素6细胞膜和细胞质染色显示，载药微球浓度增大，癌细胞数量减少，可通过调整给药浓度杀死癌细胞.

图6 激光共聚焦扫描显微镜观察Fig.6 Fluorescence images under laser scanning confocal microscope

3.2.3 细胞毒性结果

体外细胞毒性实验显示，1、3、6.25、12.5、25、50 mg/mL质量浓度组计算所得RGR均大于等于100%，空白微球和载药微球的细胞毒性反应分级均为 0 级，未对正常鼠 L929 纤维细胞造成明显的毒性反应.

3.3 栓塞微球在VX2荷瘤兔体内的栓塞效果

3.3.1 CT扫描结果

VX2荷瘤兔接受栓塞微球治疗后，肿瘤体积出现不同程度的增长.栓塞治疗21 d后，姜黄素微球栓塞组、空白微球栓塞组和造影剂组肿瘤体积分别为(4.32±1.46)、(5.96±1.07)和(9.30±1.38)cm3.姜黄素载药微球组、空白微球栓塞组肿瘤体积明显小于单纯造影组(P<0.05).

3.3.2 存活结果

VX2荷瘤兔动脉栓塞后的存活曲线，实验结果见图7.平均生存时间分别为单纯造影组 32.40 d、空白微球栓塞组37.60 d、姜黄素载药微球栓塞组 47.80 d.计算可得，姜黄素载药微球和空白微球治疗组的ILS分别为46.80%和36.60%.由此可以看出栓塞给药具有明显的治疗效果，且姜黄素载药微球栓塞组优于空白微球组.

3.3.3 H&E染色结果

肝脏组织病理学切片H&E染色结果见图8.单纯造影组肿瘤细胞形态多样，病变周围发现肿瘤巢，在肿瘤组织周围见到厚厚的纤维间隔，几乎没有血管.与空白微球组相比，姜黄素微球组可见血管内微球，周围肿瘤组织不同程度减少，并可见肿瘤边缘的凝血坏死区域.

图7 各实验组荷瘤兔 K-M 生存曲线Fig.7 K-M survival curves of tumor-bearing rabbits in each experimental group

a1、a2.单纯造影组；b1、b2.姜黄素微球组；c1、c2.空白微球组.图8 每组肝脏的组织病理学图像(H&E染色)Fig.8 Histopathological images of liver in each group (H&E stain)

4 结论

目前广泛的研究和临床实验证实，载药微球可选择性地将大部分药物递送至肿瘤部位，降低全身药物浓度，但载药微球的临床使用受限于其单一的载药模式和高昂的价格.本文以PVA为原料制备姜黄素栓塞微球.确定的最佳工艺参数为：质量分数5% PVA水溶液，含有质量分数0.5% span 80的液体石蜡溶液，1 mol/L盐酸作催化剂，乳化温度为60 ℃.扫描电子显微镜显示载药微球球形好，平均粒径为94.19 μm.生物安全性测试证明载药微球安全指数较高，对癌细胞有抑制作用.药效学实验发现姜黄素微球对兔肝癌有治疗作用.综上，本实验研制的姜黄素栓塞微球安全性高，对肝癌的治疗效果良好，有望用于临床肝癌的治疗.

5 讨论

肝动脉化疗栓塞能够在降低化疗药物毒性的同时提高疗效，应用范围广，发展前景优越.微球递药系统一直是药剂学领域的研究热点之一，姜黄素栓塞微球能够缓慢释放药物，载药量高，副作用少.国内外研究均表明，载药栓塞微球对于多种类型肿瘤的临床效果比常规栓塞和化疗好.国内外已上市销售的有DC Bead®栓塞微球(英国)、Hepasphere®栓塞微球(美国)以及CalliSphere®栓塞微球(中国).当前上市栓塞微球主要通过机械吸附或正负电荷结合方式载药，载药模式单一，同时载药种类有限(临床限于阿霉素、吡柔比星、伊立替康等)，价格昂贵.本研究将姜黄素包埋于载体内制备微球，扩大了栓塞载药微球药物的选择范围.今后实验将进一步优化制剂工艺，加速栓塞微球向临床应用阶段转化，早日实现微球的生产上市.