2.8 GHz微波辐射对大鼠空间工作记忆和识别记忆的影响及其结构基础

任 可， 姚传福， 孙 柳， 吴 悠， 刘 煜，王 惠， 徐新萍， 周红梅 ， 赵 黎， 赵小军， 彭瑞云，

(1.河北大学 教育学院， 保定 071000；2.军事科学院 军事医学研究院 辐射医学研究所， 北京 100850)

0 引言

随着我国科技的不断突破与发展,微波技术广泛应用于雷达导航和生物医疗等领域。无线通信与5G网络的出现和普及，也使微波广泛应用于日常生活中，为人们提供便利[1]。但与此同时，微波辐射已经成为继空气、水和噪声污染之后的第四大污染源，随之而来的健康危害备受关注[2]。以往研究发现，微波辐射环境暴露可导致机体神经系统障碍，并出现学习和记忆减退等损伤表现[3]。海马组织是微波辐射致脑损伤的敏感部位，海马组织结构与认知功能发挥密切相关[3-4]。学习与记忆是认知功能的重要方面，由于脑认知功能的复杂性，其分类的角度与标准多种多样。其中工作记忆在对外界信息编码和存储方面起到重要作用，它包括中央执行系统、视空间模板和情景缓冲器等方面，与资源分配、策略转换和认知灵活性相关[5]。识别记忆则是对新旧事物记忆的触发与辨别的过程[6]。Morris水迷宫经典范式可用于评价啮齿类动物空间记忆水平[7]，而水迷宫反转实验在经典范式基础之上，用新平台替代原有平台位置，动物前期学习信息被更新，需要排除旧信息的干扰对新信息进行整合的过程，可用于更加精确评价动物空间工作记忆和认知灵活性水平[7-10]；新物体识别实验则是利用动物对新异刺激的偏好来检测识别记忆的神经行为学工具[11]；二者联合分析可更加全面反映动物认知功能的多个方面。但目前，结合水迷宫经典范式及平台反转实验与新物体识别实验对大鼠空间学习记忆、工作记忆和识别记忆功能的影响鲜有报道。因此，本研究通过动物神经行为学实验观察微波辐射后大鼠空间学习、工作记忆与识别记忆功能的改变，并采用苏木素伊红组织染色观察海马结构的改变，为深入研究微波辐射致脑损伤特点和机制提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物和分组

二级雄性Wistar大鼠50只，体重(180±20)g，由北京市维通利华实验动物中心提供[许可证号：SCXK(京)2016-0006]。随机分为假辐射组(Sham 组)和微波辐射组(MW组)，每组25只。按照12 h明/12 h暗饲养，每日光照时间为 9:00—21:00，实验在10:00—18:00进行，大鼠可自由饮水进食。

1.2 微波辐射方法

采用军事医学研究院微波辐射系统进行大鼠全身均匀照射。该电磁屏蔽室内壁覆盖锥形微波吸收器，以减少反射(图1A)。辐射盒采用有机玻璃制成，围绕中心旋转对称(图1B)。微波辐射频率为2.8 GHz,平均功率密度为 30 mW/cm2，辐射时间为15 min，SAR为21 W/kg。Sham组大鼠处理条件与MW组相同，但不予辐射。

1.3 大鼠空间和工作记忆能力检测

采用水迷宫实验系统(江苏赛昂斯生物科技有限公司，中国)进行 Morris 水迷宫实验。主要分三个阶段：① 学习期。大鼠于辐射前训练 3 天。将大鼠面向池壁分别从 4 个入水点放入水中，如果大鼠在 60 s内找到平台，让其在平台上停留 15 s。如果 60 s内未找到平台，由实验者将其引至平台，学习15 s。② 定位航行实验。于辐射后6 h、1～4 d连续 5 d进行空间定位航行实验。从池壁随机入水点将大鼠放入水中，记录大鼠找到平台所用的时间，即平均逃避潜伏期(average escape latency，AEL)以及大鼠找到平台的总路程，即平均逃避路程。③ 空间探索实验：于辐射后第5天撤去平台，记录大鼠在 60 s内穿越原平台的次数及原平台所在象限时间和路程占比。以AEL和路程反映大鼠学习能力与空间记忆能力水平。以穿越原平台的次数及原平台所在象限时间和路程占比反映大鼠维持空间记忆的能力。

在第5～10天将平台转移到对侧象限，进行Morris水迷宫反转实验。实验包括定位航行反转实验和空间探索反转实验，实验过程同前，分别记录AEL、穿越原平台的次数及原平台所在象限时间、路程占比。以AEL、穿越平台的次数及原平台所在象限时间、路程占比反映大鼠空间和工作记忆水平。

1.4 大鼠识别记忆能力检测

采用新物体识别实验系统(江苏赛昂斯生物科技有限公司，中国)进行新物体识别实验。主要分三个阶段：① 适应期：于辐射后1 d，将大鼠从敞箱壁一角放入，适应10 min，实验过程不设置物体。② 学习期：于辐射后2 d在敞箱中放入两个相同圆柱体，将大鼠从敞箱一角背朝物体放入，记录10 min内大鼠探索两个圆柱体的时间。③ 测试期：测试期1在学习期结束 1 h后进行，在敞箱中放入物体，其中一个圆柱体被替换为尺寸相当的新物体(圆锥)，另一个物体为圆柱不变。每只大鼠被单独放入自由探索 5 min，并用摄像机跟踪记录大鼠探索圆柱体和圆锥体的时间，以大鼠鼻子或嘴巴接触物体或距物体≤2 cm为有效。测试期2在学习期结束 24 h后进行，敞箱中新物体被替换为另一个的新物体(长方体)，另一个物体为圆柱不变。每只大鼠实验结束后均以75%的酒精擦拭敞箱底部，防止气味残留干扰。以辨别指数(identify index，DI)反映大鼠对新旧物体的识别记忆能力，F为探索熟悉物体的时间，N为探索新物体的时间，计算公式为：DI=N/(N+F)×100%。

1.5 大鼠海马组织结构观察

于辐射后3 d和7 d，取出两组大鼠脑组织浸入10%福尔马林溶液固定7 d，将大鼠脑组织取材后进行脱水、透明、浸蜡和包埋，制备3 μm组织切片，并采用苏木素伊红法进行组织染色，中性树胶封片，采用光学显微镜(Leica，德国)观察并拍照记录。

1.6 统计学处理

本研究数据使用Excel录入，采用 SPSS 25.0统计软件分析数据，数据用(M±SD)表示。采用重复测量方差分析、独立样本t检验进行统计分析。

2 结果

2.1 大鼠空间学习记忆与工作记忆的变化

Morris水迷宫定位航行实验中大鼠运动轨迹显示，Sham组大鼠游泳路线轨迹呈直线式与趋向式，由四周向目标区域探索。MW组大鼠游泳轨迹路线呈现边缘式，部分有集中目标象限的趋势(图2A)。同时，Sham组AEL随着学习时间增加有缩短趋势(F=1.808，P>0. 05)，MW组AEL随着学习时间增加有缩短趋势(F=1.790，P>0. 05)，两组之间无显著差异。与Sham组相比，MW组大鼠于辐射后6 h、1～4 d 内AEL(F=0.018，P>0.05)与平均逃避距离均无显著差异(F=0.014，P>0.05)(图2B和2C)。

空间探索实验中大鼠运动轨迹显示，Sham组大鼠游泳路线多集中于平台象限周围，游泳轨迹呈直线式，MW组大鼠游泳轨迹路线反复画圈，多呈现随机式，没有集中目标象限的趋势(图3A)。辐射后5 d，与Sham组相比，MW组大鼠在原平台所在象限停留时间占比上显著降低(t=2.365，P=0.026<0.05)，但MW组大鼠穿越平台次数(t=1.238，P>0.05)与原平台所在象限游泳路程占比无显著差异(t=1.541，P>0.05)(图3B、3C和3D)。

图3 微波辐射后大鼠空间记忆的维持能力(Morris水迷宫空间探索)A.大鼠游泳轨迹；B.穿越平台次数(Platform crossing times)；C.平台象限时间占比(The proportion of time in the quadrant of the platform)；D.平台象限路程占比(The proportion of distance in the quadrant of the platform) *P<0.05

Morris水迷宫定位航行反转实验中大鼠运动轨迹显示，Sham组大鼠入水后，受前期平台位置影响游泳路线趋向前期目标区域，但在下个入水点更快地找到新平台位置。MW组大鼠游泳轨迹路线呈现直线式与随机式搜索，较少受前期目标平台信息的干扰(图4A)。于反转平台后1～5 d，与Sham组相比，MW组大鼠AEL(F=0.138，P>0.05)与平均逃避距离(F=0.05，P>0.05)均无显著差异(图4)。

在空间探索反转实验中大鼠运动轨迹显示，Sham组大鼠入水后，游泳路线多集中于旧平台象限周围，经过新平台象限路线较少，MW组大鼠游泳轨迹路线呈现随机式，但穿越新平台次数较多(图5A)。于反转平台后6 d，与Sham组相比，MW组大鼠穿越平台的次数(t=-1.895，P>0.05)、原平台所在象限停留时间(t=-1.037，P>0.05)和原平台所在象限路程占比均无显著差异(t=-0.831，P>0.05，图5B、5C和5D)。

图4 微波辐射后大鼠空间工作记忆的变化(Morris水迷宫定位航行反转实验)A.大鼠游泳轨迹；B.平均逃避潜伏期(AEL)；C.平均逃避路程(Distance)

图5 微波辐射后大鼠空间工作记忆的变化(Morris水迷宫空间探索反转实验)A.大鼠游泳轨迹；B.穿越平台次数(Platform crossing times)；C.平台象限时间占比(The proportion of time in the quadrant of the platform)；D.平台象限路程占比(The proportion of distance in the quadrant of the platform)

2.2 大鼠识别记忆的变化

新物体识别实验运动热图显示，在熟悉期，两组大鼠探索新旧物体的时间基本一致；在熟悉期后1 h和24 h，Sham组表现出更多探索新物体行为，MW组表现出偏好熟悉物体的行为(图6)。

图6 新物体识别实验大鼠轨迹热图A. 熟悉期大鼠轨迹；B. 测试期Ⅰ大鼠轨迹；C. 测试期Ⅱ大鼠轨迹

新物体识别实验结果显示，两组大鼠在总移动距离、平均速度和总探索时间上均无显著差异(P>0.05)，提示两组大鼠具有相同探索水平。辐射后1 h，与Sham组相比，MW组大鼠辨别指数显著降低(t=2.117，P<0.05)。辐射后24 h，与Sham组相比，MW组大鼠辨别指数呈降低趋势，但无显著差异(t=1.999，P>0.05)(图7)。

图7 微波辐射后大鼠识别记忆的变化(新物体识别实验)A.大鼠移动距离(Total Distance)；B.平均速度(Mean speed)；C.两物体总探索时间(Total object exploration)；D.辨别指数(Recognition index)*P<0.05

2.3 大鼠海马组织结构的变化

辐射后3 d，Sham组大鼠海马组织齿状回区呈正常结构，表现为神经元排列整齐，核淡染，胞质均匀(图8)。MW组大鼠海马组织齿状回区结构损伤，主要表现为神经元核固缩、深染，呈梭形；以辐射后3 d损伤严重，辐射后7 d损伤呈恢复趋势(图8)。

图8 微波辐射后大鼠海马组织结构的变化A. 辐射后3 d Sham组(左图: Scale bar=50 μm，右图：Scale bar=20 μm)；B. 辐射后3 d MW组(左图: Scale bar=50 μm，右图：Scale bar=20 μm)；C. 辐射后7 d Sham组(左图: Scale bar=50 μm，右图：Scale bar=20 μm)；D. 辐射后7 d MW组(左图: Scale bar=50 μm, 右图：Scale bar=20 μm)

3 讨论

微波辐射是300 MHz～300 GHz之间的电磁波，其在人们工作和生活各领域的应用越来越广泛[12]。其中，2～4 GHz的微波频段，常应用于WiFi、蓝牙等通信、医疗及工业中，微波暴露职业人群与普通人群常处于该波段微波辐射环境中。微波对人体产生的健康危害受到学者和广大群众关注。脑是微波辐射损伤的敏感靶点，流行病调查和实验室研究均发现，微波辐射可造成机体认知障碍[13-14]。国际上的电磁场暴露限制标准存在差异，仍需根据现实复杂情况不断更新[15]。另外，由于现代社会的发展，非电离电磁场的环境暴露水平也不断上升。因此，结合现状与本课题组以往研究，本研究采用30 mW/cm2的2.8 GHz微波辐射进行实验，以适应不断增加的环境暴露。目前，针对该频段微波辐射造成的大鼠空间工作记忆、识别记忆变化及其组织结构基础的研究尚未见报道。

动物神经行为学实验是明确动物认知、决策等神经系统功能的重要实验范式，可揭示在各种因素作用下机体认知行为功能的影响。其中Morris 水迷宫和新物体识别是最为常用的两种。Morris水迷宫实验是检测啮齿类动物认知功能的经典实验，被广泛应用于评价空间记忆水平[7]；而反转实验将不可见平台位置改变增加了大鼠寻找平台的难度，此时旧平台信息被更新，需要排除旧平台信息的干扰，将新旧信息整合后做出判断，认知过程更为复杂，可用于检测大鼠空间工作记忆能力。新物体识别是评价动物非空间记忆水平的常用行为学实验。通过设置新旧物体，比较旧刺激与当前新刺激的差异来检测动物的情景识别记忆。二者各自侧重不同记忆类型，又共同揭示了对记忆功能的不同影响。

现有研究主要采用 Morris 水迷宫行为学实验研究一定强度微波辐射对动物学习和记忆功能的影响，但研究结果存在差异。有研究发现，微波辐射后动物学习和记忆能力障碍，主要表现为辐射后动物在水迷宫定位航行实验中AEL增加，在空间探索实验中原平台所在象限时间路程百分比减少等[16-18]。但另有研究发现，微波辐射未对动物学习和记忆能力造成影响，辐射后实验动物在记忆行为上无显著性变化[19-21]。此外，尚未见结合水迷宫的延伸-反转实验研究微波辐射对工作记忆的影响。为此，本研究采用水迷宫经典范式与平台反转实验研究微波辐射对大鼠空间记忆与工作记忆功能的影响特征。结果发现，随着训练时间增加，两组大鼠的AEL均有降低趋势，表明大鼠具有一定的学习能力；于辐射后6 h至4 d，在水迷宫定位航行阶段，两组大鼠AEL与平均逃避路程均无显著差异，提示大鼠的空间学习记忆能力暂无明显改变。水迷宫空间探索实验可以排除一些随机绕圈等非空间记忆策略完成任务的因素，在定位航行阶段结束后24 h进行，可反映大鼠的长时记忆功能，并确保大鼠采用空间策略解决迷宫问题。本研究发现，于辐射后5 d，大鼠在原平台所在象限停留时间占比上显著降低，提示30 mW/cm2微波暴露可导致大鼠空间记忆维持能力下降。本研究于辐射后6 d至10 d进行水迷宫反转实验，结果发现，大鼠AEL、平均逃避路程和穿越平台的次数与原平台所在象限停留时间、路程占比均无明显改变。表明30 mW/cm2微波辐射对大鼠空间工作记忆未造成明显损伤，其原因可能与辐射组大鼠对旧平台空间位置记忆模糊，相对于新平台位置记忆干扰更小或与辐射后时间过长，微波损伤效应恢复等因素相关，未来研究可将平台反转时间相对提前，进一步研究微波对大鼠空间工作记忆的影响。另外，本研究发现，在新物体识别实验中，30 mW/cm2微波辐射后大鼠辨别指数显著降低，表明辐射后大鼠更少表现出偏好新异刺激行为。提示30 mW/cm2微波暴露可导致大鼠识别记忆能力下降。

海马体主要由海马、齿状回和下托组成，而齿状回区位于海马体中部，是神经信息传递的重要区域，海马组织是机体完成学习记忆过程的结构基础[22-23]。学习记忆功能障碍伴随组织结构损伤[24]，目前海马组织成为学习记忆功能的重要脑区。以往研究表明，微波暴露可导致海马组织结构不同程度损伤[25-27]。本研究重点关注海马组织结构变化，以明确其结构和功能的相关性。本研究发现，辐射后3 d，大鼠海马组织损伤，主要表现为齿状回区神经元核固缩、深染，呈梭形；辐射后7 d大鼠海马组织齿状回区呈恢复趋势。这与本研究动物行为学结果相吻合，辐射后3 d大鼠AEL和平均逃避路程呈延长趋势，辐射后7 d无明显差异。提示30 mW/cm2的2.8 GHz微波暴露后可导致大鼠海马组织齿状回结构损伤。

综上所述，30 mW/cm2的2.8 GHz微波辐射可引起大鼠空间记忆和识别记忆能力障碍，海马组织特别是齿状回区结构损伤是其致伤的结构基础。微波辐射造成的海马组织结构损伤和功能障碍的相关性机制仍待进一步探讨。