鼠疫耶尔森菌重组酶聚合酶核酸扩增荧光检测方法的建立

裴美娟，李淑磊，李梦蓝，刘朝阳，宋 娜，王玉飞

鼠疫是由鼠疫耶尔森菌引起的烈性传染病，又称为黑死病，曾发生几次历史大流行，对人类的健康造成巨大的危害。近年来我国时有鼠疫发生的报道，对人民的健康造成威胁。鼠疫起病急、病程短、病死率高，临床症状常表现为发热、淋巴结肿大、出血、咳嗽，呼吸困难等症状，因此进行鼠疫的早期诊断和检测至关重要。目前，鼠疫耶尔森菌常用的实验室检测方法有酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、细菌分离培养等。但这些常用的实验室检测方法存在耗时长、操作复杂、检测效率低等缺陷，难以满足现场快速检测的要求。重组酶聚合酶核酸扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)是一种等温核酸检测技术，简单快速，配合一个便携式检测设备即可实现现场的检测和判定，这使得在低资源流行环境下的即时检测成为可能。因此本试验建立了一种检测鼠疫耶尔森菌的荧光RPA方法，可特异灵敏地对鼠疫耶尔森菌进行检测，为鼠疫的现场早期检测提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料 核酸扩增试剂盒(recombinase aided amplification，RAA)(荧光型)购自杭州众测生物科技有限公司；小提质粒试剂盒，感受态DH5α购自北京全式金生物技术有限公司；pUC57购自北京华越洋生物科技有限公司。金黄色葡萄球菌、草绿色链球菌、产气荚膜梭菌、单核李斯特菌、红斑丹毒丝菌、大肠杆菌、沙门氏菌、布鲁氏菌、巴氏杆菌、流感嗜血杆菌等常见细菌的DNA由辽宁省沈阳农业大学动物科学与医学学院人兽共患病预防实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 从Genebank中下载鼠疫耶尔森菌的参考序列(CP045258.1)，在BLAST上查找其特异性区域及保守区，依据RPA引物设计指导，用Primer Premier 6软件设计特异性的引物和探针，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 DNA模板的制备 BLAST比对后选择特异性的鼠疫耶尔森菌序列，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成后插入pUC57克隆载体，转化DH5α大肠杆菌后构建克隆菌株。将克隆菌株培养后采用质粒提取试剂盒提取质粒，使用紫外分光光度计测定质粒浓度，根据质粒片段大小计算出拷贝数，作为RPA试验模板。

1.2.3 鼠疫耶尔森菌荧光RPA反应温度优化 参照RAA核酸扩增试剂(荧光型)试剂盒的说明，将25 μl A Buffer、2.0 μl上游引物(10 μm)、2.0 μl下游引物(10 μm)、0.6 μl探针(10 μm)、1 μl DNA模板、16.9 μl水的混合物加入到装有反应干粉的检测管中，再向检测管盖上加入2.5 μl的B Buffer，盖上管盖，上下颠倒充分混匀5～6次，低速离心10 s。然后放入RPA恒温扩增荧光检测仪T8(英国TwistDx公司)中，其中鼠疫耶尔森菌DNA为阳性对照，无菌水为阴性对照，同时设置3个复孔，在不同温度反应20 min，实验重复3次后判定结果。

1.2.4 鼠疫耶尔森菌荧光RPA特异性检测 为了确定鼠疫耶尔森菌荧光RPA的特异性，将金黄色葡萄球菌、草绿色链球菌、产气荚膜梭菌、单核李斯特菌、红斑丹毒丝菌的细菌DNA混合为革兰阳性菌样品作为对照组1，将大肠杆菌、沙门氏菌、布鲁氏菌、巴氏杆菌、流感嗜血杆菌的DNA混合为革兰阴性菌的样品作为对照组2，将无菌ddHO设置3个复孔，然后作为样品进行荧光RPA检测，实验重复3次后判定所建立的荧光RPA的特异性。

1.2.5 鼠疫耶尔森菌荧光RPA灵敏性检测 将质粒模板进行10倍梯度稀释，分别稀释为10～1000 copies/μl的浓度，然后分别吸取1 μl作为模板配成反应体系，将无菌水作为模板设置阴性对照，同时设置3个复孔，放入T8中进行检测，实验重复3次后判定所建立的荧光RPA的灵敏性。

1.2.6 模拟样品的检测 采用双盲法，以鼠疫耶尔森菌的质粒和大肠杆菌的DNA为材料，人为配制成50份含有不同浓度质粒的人工模拟样品，将质粒模板进行10倍梯度稀释，分别稀释为1000、100、10 copies/μl的浓度，使用所建立的荧光RPA进行检测，检测时设置3个复孔，实验重复3次，将检测结果与质粒混合情况进行比对，判定检测的准确性。

1.3 统计学处理 定量数据的显著性分析采用单因素方差分析，以<0.05为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism 6.0进行数据处理、图片制作。

2 结 果

2.1 鼠疫耶尔森菌的上下游引物设计及探针序列 通过BLAST比对发现，鼠疫耶尔森氏菌的DNA腺嘌呤甲基化酶基因1994590-1994804区间序列(图1)特异性强，与其它菌或其它种的耶尔森氏菌存在很大的序列差异，因此将其选择为RPA检测的目的基因。依据荧光RPA引物和探针的设计规则，在DNA腺嘌呤甲基化酶基因上设计了引物和探针(表1、图1)，并对其特异性进行了BLAST比对分析。

图1 鼠疫耶尔森菌特异性序列及RPA引物和探针位置

表1 试验使用的RPA引物和探针

2.2 鼠疫耶尔森菌荧光RPA反应温度的优化 以鼠疫耶尔森菌DNA质粒为模板，以上述RPA反应体系进行了不同温度下的RPA反应，以获得最优的反应温度。结果表明反应温度为35 ℃时效果最佳，阳性管(红色曲线)出现明显的荧光强度，而阴性管(紫色曲线)只发生了轻微的荧光强度改变；其他温度下阴性管出现了较大的荧光强度变化，发生了假阳性反应，同时在39 ℃时阳性的荧光强度也很低，只有1200，反应效果差(图2)。因此，在后面的试验中均采用35 ℃的反应温度。

图2 重组酶聚合酶核酸扩增反应温度的优化

2.3 鼠疫耶尔森菌荧光RPA试验特异性 为判定RPA反应的特异性，分别以鼠疫耶尔森阳性质粒、革兰阳性菌DNA、革兰阴性菌DNA为模板，在T8 RPA荧光检测仪中35 ℃反应20 min。结果表明只有含鼠疫耶尔森基因的质粒样品有明显的扩增曲线产生，而阴性对照与其他菌株混合组成的革兰阴性和阳性样品均无荧光强度变化(图3)，表明所建立的鼠疫耶尔森菌荧光RPA具有很好的特异性。

图3 鼠疫耶尔森菌重组酶聚合酶核酸扩增特异性

2.4 鼠疫耶尔森菌荧光RPA灵敏性 分别以1 μl 10～1000 copies/μl浓度的鼠疫耶尔森菌质粒为模板配成反应体系放入T8检测仪中进行检测，结果显示鼠疫耶尔森菌质粒模板浓度为1000 copies/μl的反应管中出现明显的荧光强度改变，而100 copies/μl的反应管中仅出现轻微的荧光强度改变，10 copies/μl以及阴性对照的反应管中几乎没有荧光强度改变(图4)，表明所建立的鼠疫耶尔森菌RPA检测方法具有较好的灵敏性，可检测到低至100 copies/μl的基因。

图4 鼠疫耶尔森菌重组酶聚合酶核酸扩增灵敏性

2.5 模拟样品的检测 对50份人工模拟样品的检测结果表明，所建立的鼠疫耶尔森菌荧光RPA检测方法可以从30份掺杂质粒的人工模拟样品中检出29份阳性，从20份未掺杂质粒的样品中检出20份阴性，总检测符合率为98.0%，表现出很好的检测准确性。对检测失败模拟样品的分析发现，其原因是质粒掺杂量太少，低于100 copies/μl。

3 讨 论

鼠疫是由鼠疫耶尔森菌引起的一种烈性传染病，其传染源主要是啮齿动物，传播媒介主要是鼠蚤，在我国属于甲类传染病之首。同时鼠疫菌也是生物战最有可能使用的生物剂之一。虽然当前该病流行不严重，但仍时有发生，2020-07还曾发生鼠疫病例。鼠疫具有起病急、病程短、传染性强、病死率高的特点，传统的鼠疫菌“四步检验法”及血球凝集试验在鼠疫的确诊中起着重要的作用，但是存在着操作复杂、耗时长、安全防护要求高等缺点。早期诊断可给该病的预防及治疗提供宝贵的时间，因此需要建立敏感快速的诊断方法。然而，以前常用的实验室检测方法存在要求高、耗时长、操作复杂、检测效率低等缺陷，不适合基层疾控单位和现场，因此，亟需建立一种可现场进行的简便检测方法。

RPA是一种恒温核酸扩增技术，它依赖于特定的酶和蛋白组合(重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶)，在常温下即可发生反应，5～20 min即可获得结果，可简单快速地进行病原基因的扩增，这使得在低资源流行环境下进行即时诊断成为可能。现在已有RPA应用于多种传染性疾病检测的报道，然而，尚无RPA应用于鼠疫耶尔森菌检测的报道。

为建立鼠疫耶尔森菌的荧光RPA检测方法，首先对鼠疫耶尔森菌的基因序列进行了BLAST分析，找到特异性的DNA腺嘌呤甲基化酶基因序列。随后进行了扩增温度的优化，获得了最佳的扩增温度。在此温度下进行了灵敏性、特异性和模拟样品的检测试验，表明所建立的荧光RPA方法可检出低至100个拷贝的基因，且在模拟样本中检出率高，与常见细菌核酸不发生交叉反应，快速准确。虽然本实验是建立在模拟样本的基础上进行的验证，但由于其便捷性以及高特异性和灵敏性，在鼠疫菌快速检测方面展现出了很好的应用前景，为现场检测提供新思路。