低温微生物诱导碳酸钙沉积及其在混凝土裂缝修复中的应用研究

易 丹,杨国军

(1.江苏城乡建设职业学院管理工程系，常州 213000；2.东南大学土木工程学院，南京 210096)

0 引 言

水泥基材料作为一种重要的建筑材料，是社会上使用量最大的材料。随着建筑行业对建筑寿命的高要求与水泥基行业自身的节能减排需求，水泥基材料的耐久性是如今重要的研究方向[1]。然而，水泥基材料自身的脆性以及服役环境的影响，使水泥基材料的开裂不可避免；开裂后若未能及时得到修复，外界水和侵蚀介质便会不断从材料表面缺陷逐渐渗入，最终引起水泥基材料的劣化加速[2-3]。因此，修复水泥基材料的裂缝，是延长水泥基材料寿命的重要手段之一。近十年来，采用微生物矿化技术进行水泥基材料的修补因具有很好的前景而备受关注[4-7]。然而，在微生物自修复混凝土的相关研究中，所采用的修复养护温度均较高，温度一般在20～30 ℃[8-11]。主要原因是微生物生长或酶活性均存在合适的温度范围，而微生物矿化沉积过程是以酶活性为基础的，因此，高效的酶活性是微生物矿化的关键因素之一[12-15]。目前在微生物自修复领域应用的主要是一些室温生长的微生物，这些微生物的适宜生长环境温度为20～30 ℃，多数文献[10,16-18]报道裂缝修复过程中所需的温度为20 ℃左右。尽管有文献[19]报道砂浆裂缝的最低修复温度为7 ℃，但此时的裂缝修复效果较差。然而，混凝土实际服役环境不会时刻处于理想状态，外界温度分布范围较广，温差较大。然而，目前采用的微生物自修复水泥基材料均在常温环境下进行修复，当环境温度低于常温时，微生物的生长繁殖效率低下，矿化反应很难发生，裂缝的自修复效果并不能达到要求。因此需要研发一种适用于常温环境，又适用于低温环境下的微生物自修复剂。

水泥基材料内部处于高碱性环境，其pH值一般在13.0～13.5，这种高碱性环境会对微生物的生长繁殖造成不利影响。但是当裂缝产生后，水和空气进入，水泥基材料裂缝区环境的pH值有所降低，对于宽度小于0.50 mm的裂缝，裂缝区表层溶液的pH值为11.0左右[19-20]。本文选育一种低温微生物，在10 ℃下探讨了微生物在低温碱性环境下的矿化过程。接着，将微生物自修复剂加入到混凝土中，研究了该微生物在低温环境中对混凝土早期裂缝的自修复效果。总的来说，针对在低温环境下服役的混凝土，本文为此环境下的混凝土裂缝自修复提供一定的试验结果，为微生物自修复混凝土在低温环境下的推广应用提供了理论支撑。

1 实 验

1.1 低温微生物与培养基

本文选用的微生物是一种耐碱性强、且具有良好低温活性的地衣芽孢杆菌(10037)，菌种购于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，细菌是革兰氏阳性，形状为椭圆状或柱状，大小为2～4 μm，如图1所示。细菌培养基为10.0 g/L蛋白胨、5.0 g/L牛肉膏、2.5 g/L氯化钠和1 000 mL去离子水(pH=7.0)，具体的培养基成分和功能如表1所示。将培养基装于锥形瓶中，在125 ℃的灭菌锅中灭菌25 min，接着将购买的微生物菌种接种(1%,体积分数)于培养基中进行培养(培养温度10 ℃，振荡频率170 r/min)。在微生物的生长过程中，每隔4 h测试微生物的生长情况及其溶液中的pH值变化。经过3代微生物稳定培养后，将此微生物菌液放入4 ℃的冰箱中保存。

图1 地衣芽孢杆菌形貌

表1 培养基组成

1.2 微生物细菌数量的测试

待微生物在培养箱中培养54 h后，取其上层菌液进行光密度(OD600)测试，OD600是微生物菌液在波长600 nm下的光密度，所测试的光密度值越大，则表明微生物生长的越好，细菌营养体数目越多，OD600采用酶标仪测定。

1.3 微生物生长过程中的pH值测试

采用pH计(PHS-2C, 雷磁, 中国)来测试微生物生长过程中培养基溶液中的pH值，其中pH计的精度为0.1。

1.4 Ca2+浓度测试

培养液中的Ca2+浓度可采用EDTA滴定法进行测试[18]。此外，可采用钙化速率来表征微生物的矿化效率，并且钙化速率可根据Ca2+浓度的变化来进行计算。

钙化速率是单位时间内Ca2+浓度的变化量，以符号α表示，计算方式如下：

(1)

式中：α为钙化速率;C0为初始的Ca2+浓度;Ct为培养t时间后Ca2+浓度。

1.5 碱性溶液中矿化产物的生成过程

将60 mmol Ca(NO3)2溶液加入到500 mL灭菌后培养基中，其中矿化培养基成分为5.0 g蛋白胨、2.5 g牛肉膏和1.25 g NaCl。将5 mL处于对数期生长的微生物菌液加入到培养基中，并用1 mol/L的灭菌NaOH调节培养基体系的初始pH值至10.0。随后，在10 ℃和170 r/min大气环境中的恒温振荡培养箱中培养72 h。在培养期间，每隔6 h分别对培养液中的pH值和Ca2+浓度进行测试。采用钙化速率来反映MICP的动态过程。

1.6 混凝土试件的制备

采用尺寸为φ100 mm×50 mm的圆柱形模具测试修复性能，将普通硅酸盐水泥P·Ⅱ 52.5，粉煤灰、矿粉、自来水、砂、碎石、减水剂以及包含微生物菌液和钙源的微生物修复剂，混凝土在混合搅拌过程则按GB/T 2419—2005要求，具体的配合比如表2所示。用微生物菌液代替等体积的水加入到砂浆试件中，而钙源在混凝土试件搅拌过程中放入水中溶解后添加。每个配比成型3组试件，待24 h后脱模，然后将混凝土试件脱模然放入标准养护室(相对湿度(RH)=95%,T=(20±5) ℃)养护7 d后取出制造裂缝。

表2 混凝土配合比

1.7 混凝土裂缝制作与养护方法

为模拟真实环境下混凝土裂缝，采用劈裂法使混凝土产生裂缝。在圆柱形试件上预先纵向缠绕两层胶布以防止劈拉过程中试件完全破碎，同时也为了防止裂缝过大。然后将处理过后的试件置于抗压试验机上，适当控制加载速度(0.3～0.5 kN/s)使试件产生裂缝，最后控制在裂缝宽度小于0.50 mm。随后，将造好裂缝的试件放入自来水中进行干湿循环养护，在每个干湿循环过程中，混凝土试件12 h放在空气中，12 h放入水中，其中养护水温度维持在(10±2) ℃，每隔7 d将试件取出测试裂缝的面积修复率和渗水系数[21]。具体混凝土裂缝制作和养护过程如图2所示。

图2 混凝土裂缝制作及其养护过程示意图

1.8 自修复效果表征方法

1.8.1 裂缝愈合率

对于混凝土试件表面裂缝，直接获取裂缝图像并进行检测是最为直观的方法。首先，采用体式显微镜(D780, Nikon, Japan)对试件修复前后照片进行垂直拍摄，然后利用“Image-J”软件对裂缝图像进行处理，定量分析裂缝修复前后的像素点数，最终按照不同修复时间后裂缝区的像素点数占初始裂缝像素点数的比值，即可计算出裂缝愈合率(K)，计算公式为[12]：

(2)

式中：A0为初始裂缝区像素点数；A28为修复28 d后裂缝区像素点数。

1.8.2 渗水系数

当混凝土开裂产生裂缝时，若外部有水，水将通过裂缝透过混凝土，且随着裂缝宽度的增大，渗水能力会增强。当混凝土裂缝表面被修复时，裂缝的宽度和内部空间都将减小，水的透过将受到阻碍，故一定时间内透过混凝土的水量将减少，因此可用渗水系数来表征裂缝的自修复效果。根据达西定律，渗水系数的测试方法示意图如图3所示，计算公式为[21]：

图3 渗水系数测试示意图

(3)

式中：k为渗水系数，m/s；Q为水流量，m3/s;L为试件高度，m;A为试件横截面积，m2;Δh为水头差，m。

相对渗水系数可用公式(4)计算[21-22]：

(4)

式中：η为相对渗水系数;k0为初始混凝土试件的渗水系数，m/s；k28为修复28 d后混凝土试件的渗水系数，m/s。

1.9 矿化产物和混凝土裂缝区修复产物的表征

将碱性溶液中矿化反应后的产物过滤、洗涤、干燥后，进行测试。同时也将经过28 d养护修复后混凝土裂缝表面的白色物质刮下，烘干备用。然后利用配有能谱仪的场发射扫描式电子显微镜(SEM-EDS)观察矿化产物和修复产物的形貌并测定其元素组成，并采用X射线衍射仪测定其矿物成分。测定条件为:Cu靶Kα，管压35 kV，管电流20 mA，扫描速率2 (°)/min，步长0.015°，测定范围10°～90°。

2 结果与讨论

2.1 微生物生长情况

低温微生物在10 ℃温度下的生长情况和溶液中的pH值变化如图4所示。微生物的生长繁殖过程经历了四个时期，分别为迟缓期、对数期、稳定期及衰亡期。在0～8 h细菌生长缓慢，生长曲线平坦稳定，此时处于迟缓期；8～40 h 的对数期期间，微生物快速生长繁殖，细菌数目呈现几何级增长。期间微生物不断分解培养基中的营养物质，产生碳酸，使得培养基中pH值逐渐下降；随后，细菌在40～60 h 内进入稳定期生长，此时活细菌数保持相对稳定，总细菌数达到最高水平，同时细胞代谢产物积累达到最高峰；在60 h后，由于营养物质的消耗和有害代谢产物的积累，微生物生长步入衰亡期，此时会伴随着细胞自溶现象[23]，培养基中pH值升高。

图4 低温微生物生长曲线及培养液的pH 值变化

2.2 碱性溶液中微生物诱导碳酸钙沉积过程

图5是微生物矿化过程中溶液中Ca2+浓度和pH值变化以及钙化速率和时间的关系。微生物诱导碳酸钙沉积过程中Ca2+浓度变化明显呈现三个阶段，而对照组中的Ca2+浓度和pH值则呈现逐渐下降的趋势。对于微生物组，在第一阶段(0～12 h)，溶液中pH值逐渐下降，部分游离Ca2+被结合发生沉积，致使培养液中Ca2+浓度降低。而对照组的Ca2+浓度和pH值变化与此一致，可以认为本阶段中部分Ca2+浓度的降低与细菌无直接关系，主要发生的是化学沉淀，即大气中CO2溶于培养液中而发生的碳化反应。第二阶段则是微生物诱导碳酸钙沉积的重要阶段，此时培养液中的Ca2+基本转化为CaCO3沉淀，微生物促使了CaCO3的快速生成。在12～60 h的培养时间段内，细菌快速繁殖，不断螯合培养液中的游离Ca2+，Ca2+浓度快速下降。同时由于培养液中OH-的消耗，溶液中的pH值继续降低。在第三阶段，游离的Ca2+基本消耗完全，细菌生长处于衰亡期，此时细菌会发生自溶现象，从而溶液中的pH值持续升高。而对于对照组来说，没有微生物的作用，大气环境中的CO2只是进行缓慢的溶解过程，在第一和第二阶段，溶液中的Ca2+浓度和pH值都呈现逐渐降低的趋势，都是发生简单的化学沉淀。

钙化速率的变化如图5(b)所示。从图可知，对照组的钙化速率维持恒定，约为0.18 mmol·h-1，这主要是大气中CO2的碳化作用，是化学沉淀过程。而微生物组溶液中的钙化速率在12 h后快速升高，在42 h时达到最大，此时主要是微生物的作用促进了钙化速率的增大。而后随着溶液中游离Ca2+消耗殆尽，钙化速率则开始下降。由此可知，微生物能够促进CO2的水合作用，加速CaCO3的沉积过程，大大提高了CaCO3的生成速率。

图5 矿化反应过程

2.3 矿化产物分析

待反应结束后，将两种培养基中的沉淀产物过滤，并分别用去离子水、无水乙醇各冲洗三遍，去除沉淀物质中含有的有机物和其他杂质，随后放入 60 ℃恒温干燥箱中烘至恒重，然后进行SEM-EDS和XRD测试。图6为对照组和微生物组得到的沉淀物的SEM照片。从图中可以看出，对照组的沉淀物形貌主要是以斜立方为主，晶体粒径大小分布不均，粒径约在5～50 μm，且晶粒尺寸较大。而微生物组的沉淀物形貌主要是由不规则椭球形小颗粒堆积而成，并且绝大多数晶体为球状或类球状聚集体，颗粒粒径大小分布较广，堆积非常紧密。由能谱图(见图7)分析可知所得的沉淀物主要为C、O、Ca三种元素，证明该物质是CaCO3。

图6 沉淀物的SEM照片

图7 沉淀物的EDS谱

图8是沉淀物的XRD谱，该沉淀物均是方解石晶型的CaCO3，虽说方解石主峰位置基本一致，但在主峰强度上有一定差异，对照组沉积的方解石主峰强度较微生物诱导矿化沉积的方解石要高，这在一定程度上表明，微生物诱导矿化沉积矿物结晶度较差[24-25]。在微生物诱导矿化环境中，细菌分泌的有机大分子对晶体成核和生长都会产生调控作用。一方面，细菌分泌的可溶性有机质一般带有很强的电荷负性，能吸引溶液环境中的Ca2+发生静电螯合作用，使Ca2+在细菌体附近富集形成细菌-Ca2+基元模板,有利于方解石结晶成核，这在一定程度上解释了微生物对矿物沉积的加速诱导作用。另一方面，随着基元模板上方解石晶体的继续长大，有机大分子基团的静电排斥和空间位阻作用又将抑制晶体的生长和发展，最终导致微生物诱导矿化形成的方解石晶体结晶度较差。

图8 沉淀物的XRD谱

2.4 混凝土裂缝自修复效果

2.4.1 裂缝愈合率

图9是经过28 d修复后不同混凝土试件裂缝的修复情况，从图中可知，对于基准组混凝土裂缝来说，28 d修复后，裂缝表面仅有少量白色物质生成，且裂缝宽度有所减少，主要原因可能是未水化水泥颗粒的进一步水化引起的。而非生物组较小的裂缝宽度均修复良好，大于0.25 mm的裂缝几乎未修复。加入微生物后，混凝土裂缝表面有大量白色物质生成，裂缝得到良好的修复。图10是不同初始裂缝宽度修复28 d后通过“Image-J”软件计算出的裂缝愈合率。从图中可知，对于50 μm以下的裂缝，基准组的裂缝愈合率可达100%，当裂缝宽度在100 μm以下时，非生物组的裂缝愈合率亦可达到100%，这主要是未水化水泥颗粒的二次水化以及裂缝区碳化反应造成的。对于微生物组来说，当裂缝宽度最大为0.495 mm时，裂缝愈合率也可达到80%以上，其余宽度的裂缝基本已达到95%的裂缝愈合率。总的来说，加入微生物后，能够对裂缝起到良好的修复作用，并且大大提高裂缝的愈合率。

图9 修复28 d后不同混凝土试件裂缝的修复情况

图10 修复28 d后不同混凝土试件的裂缝愈合率

2.4.2 渗水系数

表3是混凝土修复前后的渗水系数和相对渗水系数。从表中可知，28 d修复后，各种混凝土试件的渗透系数都得到一定程度的下降，而基准组混凝土渗透系数下降较少，相对渗水系数高达79.12%，主要可能是未水化的水泥颗粒的二次水化所造成的[19,26]。与修复前相比，28 d修复后，非生物组和微生物组混凝土渗水系数分别下降1个和2个数量级，相对渗水系数分别为50.91%和1.57%。造成二者差别的主要原因是微生物组混凝土裂缝表面都被白色物质填充，有效阻断了混凝土裂缝区的孔隙结构，因此，修复后混凝土试件的渗水系数得到降低，抗渗水性能可以得到大大提高。裂缝愈合率反映的是裂缝表面被矿化产物填充的状况，而渗水系数则反映的是裂缝修复后带来的抗渗性能的变化情况。试件裂缝表面修复越好，则渗水系数也就越小。因此，裂缝愈合率和渗水系数均可用来表征混凝土裂缝的自修复效果。

2.5 混凝土裂缝区修复产物分析

图11是微生物组试件裂缝区白色物质的SEM照片，从图中可知，在裂缝断裂面上有大量的球形颗粒堆积，对其局部放大，发现其主要形貌与地衣芽孢杆菌在碱性溶液中沉积的碳酸钙形貌一致，均是不规则的球形颗粒。由EDS(见图12)分析可知，裂缝区的白色物质主要具有C、O、Ca三种元素，证明裂缝区的矿化产物是CaCO3，其他少量元素(Na、P和S)可能是微生物在诱导矿化过程中的代谢产物[7]。XRD谱(见图13)表明所得的产物是方解石晶型的CaCO3，其中衍射角2θ=29.40°主要对应于方解石的(104)晶面。除了方解石衍射峰，其他杂质衍射峰的强度可忽略，这表明沉淀物质的纯度较高，并且XRD谱中各衍射峰尖锐，表明其结晶性良好。这与EDS分析相一致，证明裂缝区的白色物质是方解石CaCO3。

图11 混凝土裂缝区沉淀物的SEM照片

图12 混凝土裂缝区沉淀物的EDS谱

图13 混凝土裂缝区沉淀物的XRD谱

3 结 论

本文选用一种可在低温下生长繁殖并进行矿化的地衣芽孢杆菌，然后在碱性溶液中了研究了其在低温环境(10 ℃)的矿化能力，并通过测试溶液中的Ca2+浓度、pH值以及钙化速率的变化来揭示微生物矿化的动态过程，并对矿化产物进行表征分析。随后，将微生物菌液和硝酸钙加入到混凝土中制备出微生物自修复混凝土，并以裂缝愈合率和渗水系数来表征裂缝的自修复效果，所得结果如下：

(1)微生物的加入能够加速Ca2+的消耗，提高其钙化速率，矿化产物主要是团聚而成的球状方解石CaCO3。在微生物诱导碳酸钙沉积的过程中，由于微生物及其分泌的可溶性有机质带负电，从而使带正电荷的Ca2+吸附在菌体表面，为矿化产物的沉积提供了成核位点。此外，这种细菌-Ca2+基元模板有利于方解石结晶成核，加速了CaCO3的形成。

(2)对于宽度低于0.50 mm的混凝土裂缝，微生物和钙源的加入可以提高裂缝的修复情况。与基准组和非生物组混凝土裂缝相比，微生物组混凝土裂缝表面基本被白色物质填充，渗水系数下降2个数量级。裂缝区的修复产物主要是结晶度良好的方解石晶型的CaCO3。