沉默miR-20a-5p 的肝癌细胞恶性生物学行为及Zbed3、Axin蛋白表达情况观察

胡炜，邵安静，李春霞，杨洋

1 重庆市九龙坡区人民医院消化内科，重庆 400051；2 重庆市万州上海医院消化内科；3 重庆市陆军特色医学中心消化内科

肝癌发病隐匿、早期诊断困难、恶性程度高，临床治疗主要以手术切除肿瘤、放化疗、血管肿瘤介入综合治疗等方法为主，但治疗效果并不理想，患者年生存率为8%～10%［1］。目前人类肝癌早期发生发展的分子机制尚不明了，对肝癌发病机制进行探索对于寻求新的治疗方法及靶标有着重要意义。微小RNA（miRNA）在肿瘤细胞生物学行为中具有一定的调控作用，可与上游其他基因、长链非编码RNA及下游靶基因结合，参与调控靶基因转录，从而影响肿瘤进程。研究发现，miRNA 在原发性肝癌及慢性肝病进程的早期即存在异常表达，如肝炎、肝硬化等［2］。miR-20a-5p是miRNA 中的一员，其在胃癌、胰腺癌等组织中异常高表达，抑制其表达后可抑制肿瘤细胞增殖、转移并促进凋亡［3-4］。三结构域蛋白家族样1（TRIML1）是一种与TRMI 家族高度相似的蛋白，区别在于TRIML1 缺少B-box 域，TRIML1 最初发现于小鼠胚胎中，可与相关蛋白相互作用而促进肿瘤 的 发 生 发 展［5-7］。研 究 显 示，TRIML 家 族 中TRIM65、TRIM52和TRIM59均可以促进肝癌的发生发展，而TRIM3、TRIM7 参与抑制肝癌的发展［8-9］。目前关于miR-20a-5p 与TRIML1 关系的研究比较少。锌指蛋白3（Zbed3）可与Wnt号通路中的Axin结合，抑制Axin/GSK3β 复合体的功能，从而促进肿瘤细胞增殖［10］。2021 年5 月—12 月，本研究观察了miR-20a-5p 与TRIML1 的靶向关系，并观察其对肝癌细胞生物学行为及Zbed3、Axin 表达的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：人正常肝细胞7701及人肝癌细胞株huh-7、HepG2、SMMC7721、QGY均购自上海中乔新舟生物科技公司，用含1×105U/L 青霉素、0.1 g/L 链霉素、5µmol/L PTX 的培养液常规培养，细胞融合度为80%～90%时胰酶消化，1 250 r/min离心5 min，重悬后传代，取第四代细胞进行实验。主要试剂：TRIML、miR-20a-5p引物序列由上海联迈生物工程有限公司设计合成，PCR试剂盒购自北京百奥莱博生物科技有限公司，流式细胞仪购自上海三崴医疗设备公司，基质胶购自上海宾智生物科技有限公司，Zbed3、Axin一抗购自上海群己生物科技有限公司，辣根过氧化物酶二抗购自北京博尔希科技有限公司。

1.2 miR-20a-5p 与TRIML1 的靶向作用观察 采用双荧光素酶报告基因实验。在线数据库TargetScan（http：//www. targetscan. org/vert_71/）预 测miR-20a-5p 的直接靶基因，结果显示TRIML1 存在与miR-20a-5p 结合的潜在靶点，见图1。将融合至80%的huh-7 细胞以2×105/孔接种于6 孔板中，分为四部分，使用LipofectamineTM2000 转染试剂共转染TRIML1-WT、TRIML1-MUT 质粒和miR-20a-5p-NC、miR-20a-5p siRNA，严格按照说明书操作，检测荧光素酶相对活性。结果显示，共转染TRIML1-WT 和miR-20a-5p-NC 的细胞荧光素酶相对活性为1.12 ±0.09，共转染TRIML1-WT 和miR-20a-5p siRNA 的细胞荧光素酶相对活性为0.69 ± 0.08，二者比较P＜0.01；共转染TRIML1-MUT 和miR-20a-5p-NC 的细胞荧光素酶相对活性为1.09 ± 0.12，共转染TRIML1-MUT 和miR-20a-5p siRNA 的细胞荧光素酶相对活性为1.05±0.16，二者比较P均＞0.05；提示TRIML1是miR-20a-5p的靶基因。

图1 在线数据库TargetScan预测结果

1.3 miR-20a-5p、TRIML1 高表达肝癌细胞的筛选 采用实时荧光定量PCR 法。取第四代人正常肝细胞7701 及人肝癌细胞株huh-7、HepG2、SMMC7721、QGY，使用TRIzol 试剂提取总RNA，根据cDNA 第一链合成试剂盒说明，逆转录合成cDNA；利用荧光实时定量PCR 仪进行扩增，使用PCR试剂盒检测TRIML1、miR-20a-5p表达。PCR 反应过程：95 ℃、10 min，1 个循环；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃、20 s，40个循环。miR-20a-5p、TRIML1及内参U6 引物序列见表1，采用2-ΔΔCt法计算TRIML1、miR-20a-5p 相对表达量。结果显示，人正常肝细胞7701及人肝癌细胞株huh-7、HepG2、SMMC7721、QGY 中miR-20a-5p 相 对 表 达 量 分 别 为1.00 ± 0.04、1.73± 0.21、1.51 ± 0.13、1.53 ± 0.14、1.54 ± 0.12，TRIML1相对表达量分别为1.00±0.02、1.85±0.24、1.56±0.12、1.54±0.13、1.53±0.15；各肝癌细胞中miR-20a-5p、TRIML1 表达均高于人正常肝细胞7701，以huh-7 细胞升高最明显（P均＜0.05）；因此选用huh-7 细胞进行后续实验。

表1 miR-20a-5p、TRIML1及内参U6引物序列

1.4 细胞分组处理 将huh-7 细胞以3×103/孔接种于6 孔板中，待胞融合度至75%左右时分为7 组。模型组细胞正常培养，miR-20a-5p-NC 组转染miR-20a-5p 阴 性 对 照，miR-20a-5p siRNA 组 转 染miR-20a-5p siRNA，TRIML1-NC 组转染TRIML1 阴性对照，TRIML1 siRNA 组转染TRIML1 siRNA，TRIML1-NC+miR-20a-5p-NC 组转染TRIML1 阴性对照+miR-20a-5p阴性对照，TRIML1 siRNA+miR-20a-5p siRNA组转染TRIML1 siRNA+miR-20a-5p siRNA，均严格按照LipofectamineTM2000 试剂盒说明书进行操作。转染6～8 h 后更换培养液，48 h 后收集细胞并保存备用。

1.5 细胞TRIML1、miR-20a-5p 表达检测 参照1.2 采用实时荧光定量PCR 法检测各组细胞TRIML1、miR-20a-5p表达。

1.6 细胞恶性生物学行为观察

1.6.1 细胞凋亡能力 采用流式细胞术。取各组细胞，以2×105/孔接种于96 孔板中，常规培养24 h后弃培养液，含乙二胺四乙酸的胰酶消化细胞，2 000 r/min 离心5 min，弃上清液，PBS 清洗。加入500 µL 结合缓冲液，10 µL PI 及5 µL AnnexinVFITC，混匀，无光孵育5 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6.2 细胞侵袭能力 采用Transwell 小室实验。在小室内进行铺胶，待基质胶凝固后取各组转染后细胞进行常规消化、洗涤，500 r/min离心5 min，弃掉上清液后重悬细胞，将其接种于小室上室；将小室置于24孔板孔内进行常规培养，24 h后取出小室，PBS洗涤后，5%多聚甲醛固定15 min。用棉签擦掉小室内面基质胶和未穿过膜的细胞，行结晶紫染色，10 min后倒置显微镜下对侵袭细胞进行计数。

1.6.3 细胞迁移能力 采用Transwell 小室实验。取各组饥饿12 h 后的细胞，用无血清培养基调整细胞密度为5×105/mL，Transwell 下室加入600 µL 含10%胎牛血清的培养基，Transwell 小室上室加入100 µL 无血清的细胞悬液，将Transwell 小室置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养16 h；4%甲醛固定小室，0.1%结晶紫溶液染色，用棉签擦去膜的上室面细胞后观察、拍照，对迁移细胞进行计数。

1.7 细胞Zbed3、Axin蛋白表达检测 采用Western blotting法。取各组细胞，加入裂解液裂解并提取总蛋白，对蛋白浓度进行定量。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液进行混均，然后将其煮沸、变性。取50µg蛋白样品进行SDS-PAGE 分离蛋白质，将蛋白质转移至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h。加入一抗Zbed3（1∶200）、Axin（1∶500）及内参GAPDH（1∶2 000），4 ℃孵育过夜。PBS 漂洗，加入辣根过氧化物酶二抗（1∶5 000），室温封闭1 h。取出PVDF 膜，PBS 漂洗、DAB显色后照相。采用Image J图像分析软件定量分析条带灰度值，计算Zbed3、Axin蛋白相对表达量。

1.8 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.0统计软件。计量资料采用Shapiro-Wilktest 正态性检验方法，呈正态分布以-x±s表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验和SNK 法；非正态分布以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞TRIML1、miR-20a-5p表达比较 模型组、miR-20a-5p-NC 组、TRIML1-NC 组、TRIML1-NC+miR-20a-5p-NC 组细胞TRIML1、miR-20a-5p 相对表达量比较P均＞0.05。与模型组、miR-20a-5p-NC 组、TRIML1-NC组、TRIML1-NC+miR-20a-5p-NC组比较，miR-20a-5p siRNA 组、TRIML1 siRNA 组、TRIML1siRNA+miR-20a-5p siRNA 组细胞TRIML1、miR-20a-5p 相对表达量均降低，且TRIML1 siRNA+miR-20a-5p siRNA组降低更明显（P均＜0.05）。见表2。

表2 各组细胞TRIML1、miR-20a-5p相对表达量比较（±s）

表2 各组细胞TRIML1、miR-20a-5p相对表达量比较（±s）

注：与模型组比较，aP＜0.05；与miR-20a-5p-NC 组比较，bP＜0.05；与miR-20a-5p siRNA 组比较，cP＜0.05；与TRIML1-NC 组比较，dP＜0.05；与TRIML1 siRNA 组比较，eP＜0.05；与TRIML1-NC+miR-20a-5p-NC组比较，fP＜0.05。

组别模型组miR-20a-5p-NC组miR-20a-5p siRNA组TRIML1-NC组TRIML1 siRNA组TRIML1-NC+miR-20a-5p-NC组TRIML1 siRNA+miR-20a-5p siRNA组TRIML1 1.00±0.02 0.98±0.02 0.72±0.07ab 0.96±0.03c 0.78±0.05abd 0.97±0.02ce 0.54±0.04abcdef miR-20a-5p 1.00±0.04 0.97±0.01 0.74±0.06ab 0.95±0.05c 0.76±0.07abd 0.96±0.04ce 0.48±0.05abcdef

2.2 各组细胞凋亡率、迁移细胞数、侵袭细胞数比较 模型组、miR-20a-5p-NC 组、TRIML1-NC 组、TRIML1-NC+miR-20a-5p-NC 组细胞凋亡率、迁移细胞数、侵袭细胞数比较P均＞0.05。与模型组、miR-20a-5p-NC组、TRIML1-NC组、TRIML1-NC+miR-20a-5p-NC 组比较，miR-20a-5p siRNA 组、TRIML1 siRNA组、TRIML1 siRNA+miR-20a-5p siRNA 组细胞凋亡率均升高、迁移细胞数及侵袭细胞数均降低，且TRIML1 siRNA+miR-20a-5p siRNA 组变化更明显（P均＜0.05）。见表3及OSID码图1、2。

表3 各组细胞凋亡率、迁移细胞数、侵袭细胞数比较（±s）

表3 各组细胞凋亡率、迁移细胞数、侵袭细胞数比较（±s）

注：与模型组比较，aP＜0.05；与miR-20a-5p-NC 组比较，bP＜0.05；与miR-20a-5p siRNA 组比较，cP＜0.05；与TRIML1-NC 组比较，dP＜0.05；与TRIML1 siRNA 组比较，eP＜0.05；与TRIML1-NC+miR-20a-5p-NC组比较，fP＜0.05。

组别模型组miR-20a-5p-NC组miR-20a-5p siRNA组TRIML1-NC组TRIML1 siRNA组TRIML1-NC+miR-20a-5p-NC组TRIML1siRNA+miR-20a-5p siRNA组细胞凋亡率（%）3.18±0.34 3.48±0.31 13.84±2.37ab 3.56±0.28c 13.45±2.16abd 3.43±0.17ce 22.48±2.37abcdef侵袭细胞数（个）84.23±7.65 83.86±7.82 52.37±4.63ab 83.91±7.74c 51.25±4.82abd 82.69±8.14ce 30.14±2.85abcdef迁移细胞数（个）95.34±8.26 94.85±8.62 45.86±4.84ab 94.92±8.41c 46.32±4.39abd 93.62±9.87ce 28.46±2.30abcdef

2.3 各组细胞Zbed3、Axin 蛋白表达比较 模型组、miR-20a-5p-NC 组、TRIML1-NC 组、TRIML1-NC+miR-20a-5p-NC 组细胞Zbed3、Axin 蛋白相对表达量比 较P均＞0.05。与 模 型 组、miR-20a-5p-NC 组、TRIML1-NC 组、TRIML1-NC+miR-20a-5p-NC 组 比较，miR-20a-5p siRNA 组、TRIML1 siRNA 组、TRIML1 siRNA+miR-20a-5p siRNA 组 细 胞Zbed3 蛋白相对表达量均降低、Axin 蛋白相对表达量均升高，且TRIML1 siRNA+miR-20a-5p siRNA 组变化更明显（P均＜0.05）。见表4、OSID码图3。

表4 各组细胞Zbed3、Axin蛋白相对表达量比较（±s）

表4 各组细胞Zbed3、Axin蛋白相对表达量比较（±s）

注：与模型组比较，aP＜0.05；与miR-20a-5p-NC 组比较，bP＜0.05；与miR-20a-5p siRNA 组比较，cP＜0.05；与TRIML1-NC 组比较，dP＜0.05；与TRIML1 siRNA 组比较，eP＜0.05；与TRIML1-NC+miR-20a-5p-NC组比较，fP＜0.05。

组别模型组miR-20a-5p-NC组miR-20a-5p siRNA组TRIML1-NC组TRIML1 siRNA组TRIML1-NC+miR-20a-5p-NC组TRIML1siRNA+miR-20a-5p siRNA组Zbed3 2.45±0.23 2.38±0.27 1.46±0.12ab 2.36±0.25c 1.48±0.14abd 2.41±0.20ce 0.87±0.07abcdef Axin 1.02±0.03 1.04±0.03 1.85±0.14ab 1.05±0.02c 1.87±0.12abd 1.03±0.02ce 2.63±0.25abcdef

3 讨论

肝癌的发生发展受外部环境影响，在我国肝炎病毒感染是导致肝癌发生的重要因素之一，同时也与患者的遗传背景、DNA 损伤、免疫调节等因素有关。化学药物治疗是中、晚期肝癌的一个重要治疗手段，尽管新的抗癌药物及化疗方案不断推出，但疗效仍不尽人意。miRNA 作为重要的调控分子，对肿瘤细胞的异常增殖、转移等恶性生物学行为起着重要的调节作用［11］。罗和生等［12］研究显示，miR-20a-5p 低表达可促进胰腺癌细胞凋亡。陈杰等［13］研究显示，miR-20a-5p在结肠癌细胞中异常高表达，降低其表达后可通过靶向抑制β-catenin 表达，从而抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。本研究结果显示，肝癌细胞中miR-20a-5p 高表达，转染miR-20a-5p siRNA后miR-20a-5p 表达降低，同时肝癌细胞凋亡增加，侵袭、迁移数量减少，提示沉默miR-20a-5p 可抑制huh-7细胞的恶性生物学行为。

随着对肿瘤认识的不断加深，学者对肿瘤相关因子的研究逐渐从单一分子向家族分子或序贯式关联分子群转变。肿瘤的发生发展过程并非由单一分子发挥作用，大部分是由众多分子相互作用进而传递分子信号，从而产生相应的细胞或生物学行为。已有报道提示，miRNA 可通过调控相关蛋白因子表达参与调控细胞生物学行为［14-15］。TRIML1 在天然免疫应答、细胞分化、转录调节、细胞骨架重塑、细胞发育、细胞周期和凋亡、DNA 损伤修复等生理过程中起着重要作用，可通过调节基因表达、细胞增殖、DNA 损伤修复和凋亡等信号通路在肿瘤的发生发展中发挥作用，还可通过调控相关信号通路在炎症向肿瘤的发展过程中发挥作用［16］。郭瑛等［17］研究显示，沉默miR-20a-5p 可促进肝癌细胞凋亡，抑制细胞增殖。本研究双荧光素酶报告基因实验结果显示，TRIML1 是miR-20a-5p 的靶基因，受miR-20a-5p的正向调控；本研究PCR结果显示，miR-20a-5p在肝癌细胞中的表达明显升高，在转染miR-20a-5p siRNA 后肝癌细胞miR-20a-5p 及TRIML1 表达均降低，此时肝癌细胞凋亡率升高、迁移和转移能力降低，这提示沉默miR-20a-5p 抑制肝癌细胞的恶性生物学行为的机制可能与降低TRIML1表达有关。

Zbed3 可与Wnt 通路中的Axin 结合，从而发挥抑制Axin/CSK3β 复合体功能的作用［18］。Wnt 通路异常激活与肿瘤的发生发展密切相关，Axin 是该通路的重要分子［19］。研究证实，体外转染Zbed3 siRNA后，可通过调控Axin/CSK3β复合体的功能，抑制肺癌细胞的增殖和侵袭能力［20］。本研究结果显示沉默TRIML1、miR-20a-5p 表达后，肝癌细胞Zbed3 表达均明显降低，而Axin 表达明显升高，结合沉默TRIML1、miR-20a-5p 表达后肝癌细胞恶性生物学行为的改变，提示Zbed3 及Axin 表达改变可能是与其调节癌细胞凋亡、侵袭及迁移的相关机制。

综上所述，沉默miR-20a-5p 表达可抑制肝癌huh-7 细胞的侵袭、转移及Zbed3 表达，并促进细胞凋亡及Axin 蛋白表达，其机制可能与正向调控TRIML1表达有关。