6种木兰科植物叶片气孔的空间分布特征*

李依蓉，熊栋梁，王容，焦亚冰，刘梦菂，于可心，郭旭晨，时培建

(1.南京林业大学 竹类研究所，江苏 南京210037；2.华中农业大学 植物科学技术学院，湖北 武汉430070)

叶片是植物进行光合作用、蒸腾作用以及维持自身热平衡的重要器官[1]。对大多数物种来说，气孔是保护植物水力系统的安全阀[2-3]。在适度的水分胁迫下，植物会通过关闭气孔减少水分流失，并减少木质部的栓塞[4-6]。为实现光合作用的碳固定，CO2必须通过气孔从大气中进入叶片内部[6-8]。缺乏气孔的植物将在个体大小和栖息地范围方面受到限制，而由于突变失去气孔的植物则不能存活[9-10]。在4×108a的历史中，气孔的基本结构几乎没有发生变化[11-12]，大小和密度却有明显的变化[13-14]。自然界中的大多数植物都属于气孔下生，这种模式可能有助于防止叶片水分流失[15-16]。

叶片表面气孔的数量和空间分布是影响叶片气体交换效率至关重要的因素，气孔模式以及叶肉细胞的结构和密度是决定最大潜在气体通量的关键[17]。Baresch等[18]认为气孔导度与水力导度之间是正相关关系。植物对气孔投资的过度或不足都会影响植物的生产力[10]。为让气孔能够正常发挥作用，气孔之间需要有足够的间距[19]。单细胞表皮间距假说认为相邻两个气孔之间至少要有1个表皮细胞将他们分隔开[20]。但同时为了促使叶片的气体交换速率达到最大，叶片表面需要有足够数量的气孔[21]。因此，了解植物如何向气孔分配叶片表皮空间以实现碳需求和水分利用之间的平衡是十分重要的[22]。

Xiong和Flexas[23]通过对61种植物的研究发现气孔密度、气孔大小和叶脉密度之间存在强烈的相互协调的关系。气孔密度在很大程度上决定水分的需求，而叶脉密度则决定水分的供应[24-25]，以最优的成本利用水资源要求叶脉和气孔均匀分布于叶片[26]。还有研究显示维管束鞘和气孔之间同样存在对表皮空间的竞争[18]。双子叶植物的层级网状叶脉由许多网孔眼构成，在一个网孔眼中分布有大量的气孔，气孔密度与气孔大小之间呈现负相关关系[27]。对于典型的层级网状叶脉，研究气孔在网孔眼水平上的空间关系具有重要意义[28-29]。

空间点格局分析是一种现代统计工具，用于探索、拟合和预测给定研究区域内若干个不重叠的点(称为事件)之间的空间关系[30-31]，主要用于研究点的分布类型[32]。点过程模型的基本构件是泊松过程，完全空间随机性(completely spatial randomness，CSR)是用来判断事件空间关系的一个基准[31]。Ripley提出的K函数是稳定的、各向同性点过程二阶属性的特征化表示，被广泛用于分析空间和时空点格局，以检测事件在不同距离尺度下的排斥、随机和聚合关系[33]，在以往生物学研究中的应用主要集中在流行病学和宏观生态学[34-36]。若在植物叶片气孔空间关系研究中单纯地使用气孔密度作为空间分布的一阶特征，并不能较好地解释其气孔的空间分布特征，因此使用重复性空间点格局分析方法研究气孔中心空间分布的二阶特征，使结果更加可靠。由于研究区域的面积、事件的特征和调查成本的限制，大多数空间点格局分析方法都是基于单一点格局数据，而非重复的点格局数据，这通常会使结论不够稳妥[37-40]。

木兰科(Magnoliaceae)植物属于双子叶植物的原始类群，其对有花植物的起源、系统发育和进化的研究具有重要的价值[41-42]，它们所具有的典型的分层网状叶脉系统[43]，被认为是植物进化上的重要创新[44]。由于木兰科植物网状叶脉发达，网孔眼面积分布相对均匀，位于单个网孔眼中气孔可能也趋于均匀或随机分布，这有利于减少水分从叶脉到气孔的距离，提高叶脉的水力导度。此外，若木兰科植物遵循单细胞表皮间距假说，气孔与表皮细胞之间存在空间竞争，则气孔应尽可能地密集排布，会在小尺度内反映出气孔均匀分布的特征。Shi等[45]使用重复性的空间点格局方法分析阔瓣含笑(Micheliacavalerieivar.platypetala)叶片的气孔分布，得到该物种气孔呈均匀分布的结果，但该单一物种得出的结论是否适用于其它物种，值得进一步探讨。因此，本研究选取6种木兰科植物作为研究材料，试图解决以下问题：(1)在特定距离尺度下，气孔之间是否存在空间排斥、空间聚集或缺少空间互动；(2)同一叶片上的不同位置之间，气孔空间排列是否存在显著差异；(3)利用重复的空间点格局数据是否能比利用单一的空间点格局数据获得更稳健的气孔空间关系结论。

1 材料与方法

1.1 植物叶片材料

于2020年9月在江苏省南京市南京林业大学校园内采集了6种木兰科植物的叶片，分别是木兰属(MagnoliaL.)的玉兰(MagnoliadenudataDesr.)、荷花玉兰(M.grandifloraL.)、紫玉兰(M.lilifloraDesr.)、二乔木兰(M.soulangeanaSoul.-Bod.)和含笑属(MicheliaL.)的含笑〔Micheliafigo(Lour.)Spreng.〕和金叶含笑(M.foveolataMerr.ex Dandy)(图1)。每个物种分别从3～5棵长势健康旺盛的成树冠层中层外围的东西南北4个方位各采集叶片5～10片，采集时选择植株上健康无虫害和新鲜完整的叶片，不区分新老叶片，每个物种采集叶片100片。

1.2 实验方法

叶片气孔的显像采用离析法，详细操作参照焦亚冰等[46]。制片采用标准级显微镜载玻片(45°角，抛光边，单头单面蒙砂，25 mm×75 mm，1～1.2 mm)、免洗盖玻片(24 mm×60 mm，0.13～0.16 mm，世泰)；镜检采用生物显微镜(Leica DM2500，徕卡显微系统上海有限公司，中国上海)，使用连接在生物显微镜上的DELL电脑(DELL OptiPlex 3020、中国大陆)的LAS X.lnx软件(版本3.4.2.18368、Leica Microsystems CMS GmBH、德国)拍照。每种植物拍摄了40～60片叶片的气孔图像(因为所采集的100片叶子有的在切片过程中不能成功，保留30个以上的有效样本是分析能够得到稳妥性结果的保障)。

因为木兰科植物叶脉为分层网络结构，距离中脉位置不同，叶脉密度和网眼(不同级别叶脉形成的封闭小多边形)大小不同，气孔的空间分布特征可能会有梯度变化，因而我们对每个物种的叶片从叶缘到中脉选择3个切片位置以全面地反映气孔的空间分布特征。图2为金叶含笑叶片从叶缘到中脉选取的3个切片位置，其中6-49-1、6-49-2、6-49-3分别代表3个切片，其中编号的第一个数字代表物种编号，第二个数字代表叶片编号，第三个数字代表位置编号。每个切片大小为[0,1 200 μm]×[0,900 μm]。

1.3 气孔中心数据的获得

使用图形处理软件ImageJ(https://imagej.nih.gov/ij/index.html)和多点分析插件(https://imagejdocu.tudor.lu/macro/multiple_points)用来提取气孔中心的空间平面坐标。在提取过程中，人工选择每个点的中心位置作为气孔中心坐标。

在[0,1 200 μm]×[0,900 μm]的窗口内提取气孔平面坐标。图3是6种木兰科植物叶片最宽处3个位置组合的18个剖面图，图4是6种木兰科植物叶片最宽处3个切片中气孔中心提取点。

1.4 重复性空间点格局分析方法

K函数是稳定的各向同性点过程二阶属性的特征化表示，它在距离s处的定义为[30,32-33]

λ·K(s)=E〔N0(s)〕

式中：λ表示研究区域内单位面积点的平均数量；E表示期望值；s表示给定的距离尺度，N0(s)表示研究区域内到任意一点距离≤s的点的数量。对于完全空间随机化的点过程，K(s)=πs2；若K(s)>πs2，暗示事件在空间上相互吸引，事件趋于聚集分布；当K(s)<πs2时，则暗示事件在空间上相互排斥，构成均匀分布；当K(s)=πs2时，事件倾向于随机分布，即在该尺度下，事件之间不存在空间上的相互作用[30-31]。

K(s)函数的估计式为

式中：|A|表示研究区域的面积；n表示事件(比如点)的数量；ωij是边缘校正的权重，等于圆的周长与圆落进研究区域内的弧长之比，当以研究区域内的点为圆心、半径为s的圆完全落入研究区域时，ωij等于1；I(sij)是s的指示函数。

假设这里有g个处理组(叶片上不同位置的切片)，使用i表示第i个组(i=1,2,3,…,g)。

设想第i个组有ri个重复(叶片的数量)，使用j表示第j个重复。nij表示第i组的第j个重复对应的点的数量，则

第i个组总的点数量为：

所有组的点的总数量为：

K(s)的组内平均值：

K(s)的组间平均值：

引入D统计量来检验组间K函数是否存在显著性差异[40]：

式中，ω(s)=s-2是一个距离加权函数。利用基于D统计量的蒙特卡罗模拟进行显著性检验[39]。

蒙特-卡罗检验的步骤：

(1)计算一组残差K函数：

(2)将残差K函数随机重排，然后计算：

本研究对6种木兰科叶片最宽处的3个位置(叶缘到中脉)的K函数之间是否存在显著性差异，以及同一位置不同物种间的K函数是否有显著性差异进行检验。为了稳定K函数的方差，在重复性空间点格局使用了L(s)-s函数[31-32]：

为了行文方便，下文根据数据估计的L(s)-s函数亦称L(s)-s函数。

使用基于R(4.0.3版本)的“spatstat”(1.61-0版本)和“splancs”(2.01版本)软件包，通过编程执行重复性空间点格局分析。

2 结果与分析

研究显示在所观察的叶片显微视野中，没有发现气孔聚集现象。在较小尺度内(≤100 μm)，沿着叶片宽度轴上的气孔之间存在互相的空间排斥，气孔具有均匀分布的特征，即发现了气孔对叶片表皮空间竞争的证据。在较大尺度下(>100 μm)，气孔之间不存在空间相互作用，即气孔具有随机分布的特征。

2.1 同一物种不同位置L(s)-s函数的比较

通过对6种木兰科叶片最宽处的3个位置(叶缘到中脉)的L(s)-s函数之间是否存在显著性差异进行比较，结果发现玉兰、荷花玉兰、紫玉兰、二乔木兰4种木兰属植物叶片最宽处的3个位置之间的L(s)-s函数不存在显著差异(P分别为0.993、0.08、0.561和0.378)，3个位置两两之间的L(s)-s函数也不存在显著差异，即4种木兰属的不同位置的气孔空间分布无显著性差异，叶片3个位置之间的气孔空间结构特征是相似的。含笑叶片最宽处的3个位置之间的L(s)-s函数存在显著差异(P=0.023 < 0.05)，然而2号位置和3号位置之间的L(s)-s函数不存在显著差异(P=0.195 > 0.05)；金叶含笑叶片最宽处的3个位置的L(s)-s函数之间没有显著差异(P=0.101 > 0.05)，然而2号位置和3号位置之间的L(s)-s函数存在显著差异(P=0.029 < 0.05)；在2种含笑属植物中，叶片不同位置之间的气孔空间结构特征存在差异。根据图5可知，同一物种从叶缘到中脉的不同位置的气孔之间是排斥关系还是独立关系的尺度临界值是不同的。

2.2 不同物种同一位置L(s)-s函数的比较

重复性空间点格局分析结果表明，不同物种同一位置(分别为1号位置、2号位置、3号位置)之间L(s)-s函数有显著差异。对于1号位置(靠近叶缘处)，除了玉兰和二乔木兰之间的L(s)-s函数没有显著差异外(P=0.064 > 0.05)，其余两两物种之间的L(s)-s函数均存在显著差异；对于2号位置，除了玉兰和荷花玉兰、荷花玉兰和紫玉兰、荷花玉兰和二乔木兰以及荷花玉兰和金叶含笑之间的L(s)-s函数不存在显著差异外(P分别为0.182、0.232、0.055和0.051)，其余两两物种之间的L(s)-s函数均存在显著差异；对于3号位置(靠近中脉处)，除了玉兰和荷花玉兰之间的L(s)-s函数不存在显著差异外(P=0.105 > 0.05)，其余两两物种之间的L(s)-s函数均存在显著差异。根据以上结果可知，6种木兰科植物叶片同一位置的气孔空间分布和空间结构特征存在差异。基于组的平均的L(s)-s函数的曲线比基于单片叶片的L(s)-s函数的曲线更平滑，这表明基于组的平均的L(s)-s函数的结论更加稳妥(图6)。

3 讨论与结论

3.1 空间排斥和独立

理论上似乎气孔密度越高，对植物的生理活动越有利，但气孔数量的增加需要叶片投资增加，过度地投资会影响植物生产力，叶片表皮分配给气孔的空间是有限的[10,22]。并且从发育限制的角度来看：过高的气孔密度会导致相邻气孔之间的接触增加，这对气孔正常功能的运转有很大的负面影响[47-48]。本研究中所观察的所有的叶片显微视野中，没有发现气孔聚集现象，呈现出均匀分布，从图7可以看出，气孔与气孔之间大约保持一个表皮细胞的间距，证实了单细胞表皮间距假说的有效性。在小尺度内，气孔之间存在对叶片表皮空间的竞争。因此，为保证气孔功能正常地运作，气孔之间需要有适当的间距。

如何有效地构建能够提供充足水分以弥补蒸腾损失的叶片是植物发育的一个主要问题，其核心是气孔密度和叶脉密度之间的平衡[49-50]。Lei等[51]发现干旱胁迫能显著增加气孔密度和叶脉密度的比值，这意味着叶脉提高了植物支持气孔开放的能力，当植物从干旱胁迫中恢复时，开放的气孔会增加叶脉密度，从而促进光合作用[52-53]。因此，在田间光饱和条件下，当气孔附近的蒸发表面的水分供应刚好足以维持气孔完全开放时，叶脉和气孔的投资利用效率最高[54]。当气孔密度超过一定的范围就会增加气孔投资成本。许多研究都表明，气孔密度与叶脉密度之间呈现正相关关系，气孔与叶脉的演化具有密切的协调关系[23,55]，对于维持植物叶片水分流失和供应的动态平衡具有重要的作用[56]。由于维管束鞘的薄壁细胞密集堆积并延伸至表皮，占据了表皮空间，所以大多数植物通常在叶脉上方的表皮没有气孔分布[57-58]。

图5显示，从叶缘到中脉的3个位置上，区分气孔之间排斥关系和独立关系的尺度临界值也是不同的。由于实验设计的限制，目前还不清楚区分气孔之间排斥关系和独立关系的尺度临界值是否与临近叶脉的层级有关。在本实验中，制作切片时尽可能地避开了中脉和二级脉，切片中包含的大多是细脉的维管束鞘延伸。在今后的研究中，在不同层级的叶脉附近选取位置制作装片是很有必要的，以考察区分气孔之间排斥关系和独立关系的尺度临界值是否与脉序有关。本研究选择气孔所在网眼时尽量避开了二级脉，因为不同级别脉序是否对相邻气孔的空间分布特征产生影响尚不明确，将来值得进一步深入研究。

3.2 气孔中心空间依赖关系

通过比较叶片上不同位置的L(s)-s函数，发现在4种木兰属植物中，叶片最宽处的3个不同位置之间的气孔结构特征和空间关系基本是相似的；而在2种含笑属植物中，靠近叶缘的位置和靠近中脉的位置之间的气孔结构和空间关系存在显著差异。本研究中所选取的木兰属的植物多为落叶物种，含笑属的植物多为常绿物种。在木兰科的进化系统中，含笑属为较进化的类群，木兰属为较原始的类群[41]。Liu等[59]通过研究5种落叶玉兰属和5种常绿含笑属植物，发现在干旱季节，落叶种会完全落叶，常绿种的叶片的光合速率和气孔导度较雨季有所下降。在雨季，常绿物种的叶片的水力导度通常比落叶物种的高；而在光合速率和气孔大小方面，落叶物种通常高于常绿植物。因此我们猜测不同的气孔空间分布模式可能是不同物种对环境的适应策略，这种差异是影响不同物种在相同环境下共存的因素[60-62]。今后围绕相同分类单元(比如科、属)常绿和落叶物种间气孔空间分布特征的对比、同一物种不同地理种群气孔空间分布特征的对比研究值得进一步开展，因为本研究选取物种数量有限，特别是含笑属植物只有两种，无法进行详尽地比较。

3.3 基于重复性空间点格局L(s)-s函数的估计值

结果显示，基于组的平均的L(s)-s函数的曲线比基于单片叶片的L(s)-s函数的曲线更平滑，这表明基于重复的模式数据的结论更加稳妥。在以往的对于非重复性空间点格局的研究中，L(s)-s函数的估计值在不同距离尺度上的稳妥性在很大程度上被忽视了。与单一模式数据或重复次数较少的模式数据相比，重复的次数越多，L(s)-s函数的估计曲线就越平滑，这反映了空间二阶特征的总体趋势。单一个体呈现的模式难以说明一个平稳的过程，利用重复的空间点格局数据可以更好地解释植物的气孔分布情况。而本研究亦在侧重于对这种方法详细地阐述和介绍，便于后继研究者继续应用此种方法研究其他物种材料。

所研究的6种木兰科植物约以100 μm为临界，在此尺度以下，木兰科植物气孔存在空间的排斥作用，即气孔具有均匀分布的特征；在此尺度以上，气孔不存在空间的互作，即气孔具有随机分布的特征。对于所研究的4种木兰属植物而言，位于靠近叶缘的气孔的空间分布结构和靠近叶片中脉的气孔的空间分布结构没有显著性差异；而对于所研究的两种含笑属植物而言，两个位置的气孔分布结构存在显著性差异；此外，对于介于含笑属植物靠近叶缘位置和靠近中脉位置的气孔而言，其空间分布特征有的和前者相同，有的与后者相同，说明中间位置气孔的空间分布结构不能代表叶片中气孔空间分布特征的典型区域，在以后的研究中需要分叶缘部和中脉部分别选取。这种结果和叶脉脉序必然有着密切联系，这种联系值得进一步深入、细致地探究。