威宁短柱油茶插穗生根发育及生理特性研究*

刘燕

(贵州省生物研究所，贵州 贵阳 550009)

油茶(Camelliaspp.)是对山茶属(CamelliaL.)植物中种子含油率较高且有一定栽培经营面积的树种的统称[1]。油茶作为我国重要的木本油料树种，距今已有2 300多年的栽培和利用历史[2]。油茶树全身都是宝，其在食品、药品、化工等方面用途广泛，同时，其生态适应性强，既可作绿化荒山荒地之用又能作保持水土、涵养水源之用，具有很高的经济和生态效益[3]。威宁短柱油茶(CamelliaweiningensisY.K.Li)属山茶科(Theaceae)山茶属植物，是一种野生油茶，1977年发现于贵州省威宁县[4-5]，1980年该种确立[5]，1998年归并入怒江红山茶(C.saluenensisStapf ex Bean)[6]，威宁短柱油茶成为怒江红山茶威宁种源的统称。威宁短柱油茶除了具有普通油茶耐旱、耐土壤瘠薄的特性外，还具有耐寒、果实早熟、壳薄、出油率高、油质好等特性[5]，具有很高的开发利用价值。目前，威宁短柱油茶种苗繁育方式主要以种子繁殖为主，但种子育苗周期长，无法在短时间内满足大量用苗需求。扦插繁殖已成为油茶快速育苗技术之一[7]。威宁短柱油茶生长缓慢，扦插生根困难，要想获得高效扦插繁育技术，须先了解其插穗生根过程及其生根机理，才能解决其生根率低、发根慢等生产问题，从而为威宁短柱油茶产业发展奠定坚实的基础。

有关油茶扦插繁殖技术的研究已有较多报道，但仅有少部分研究者关注了其生根机理[8-10]。如：王瑞等[8]研究表明可溶性糖、可溶性蛋白含量积累和POD活性对普通油茶(C.oleiferaAbel.)的扦插有一定影响；谢一青等[9]发现PPO、POD、IAAO 3种酶活性会影响小果油茶(C.meiocarpaHu,)和普通油茶扦插生根；叶小萍等[10]则认为插穗C/N比是软枝油茶2号(C.oleifera‘Cenxiruanzhi II’)生根的关键，比值越高其生根率越高。然而，威宁短柱油茶扦插生根机理却鲜有报道。本研究以15 a生威宁短柱油茶半木质化枝条为试验材料，研究其插穗在扦插生根过程中的外部形态、内部解剖学结构及插穗内源激素、酶活性和营养物质的动态变化，以期从形态学、解剖学和生化特性方面了解其插穗生根过程及其生理生化特性，为威宁短柱油茶扦插育苗技术体系的建立提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验在贵州省威宁县炉山镇新丰村新秀合作社简易大棚内进行，扦插时间为2020年8月。扦插前将大棚内土壤耙平，开厢面，在每个厢面上铺垫10 cm厚的黄沙壤，再铺设3～5 cm厚的珍珠岩构成苗床。选取15 a生威宁短柱油茶半木质化枝条，制备成插穗，插穗长约5～6 cm，上剪口平齐下剪口斜剪呈马蹄状。将插穗分成2组，每组500株，一组使用生根剂处理(速蘸ABT生根液1 000 mg/L 5s)(处理组)，一组使用清水处理(对照组)，将处理好的插穗插入苗床中(扦插深度以腋芽和叶柄露出土面为准，叶片统一为一个方向)，浇足水后按张云龙等[11]覆膜方式在苗床上覆盖透明膜保湿。简易大棚外部覆盖遮阳网(遮阳率75%～80%)，棚内保持湿度85%、温度28 ℃。

1.2 试验方法

1.2.1 生根过程形态学观察

自扦插日始的90 d内每隔5 d检查1次插穗。每次观察插穗基部外部形态并拍照，记录插穗出现愈伤组织时间、愈伤组织大量形成时间、不定根发生时间和不定根大量形成时间。

1.2.2 生根过程解剖学观察

在插穗出现愈伤组织时期、愈伤组织大量形成时期、不定根出现时期和不定根大量形成时期4个阶段取样，每次取样5根。采用石蜡切片法制片、番红固绿染色，使用Nikon光学显微镜观察插穗茎的解剖结构，并拍照。

1.2.3 生根过程生理生化特性测定

自扦插日始60 d内每隔15 d取1次样，每次取样5根，测定插穗生根过程中生理生化特性。可溶性糖采用蒽酮比色法、可溶性蛋白采用考马斯亮蓝法、过氧化物酶(POD)采用愈创木酚比色法、多酚氧化酶(PPO)采用邻苯二酚比色法测定[12]。吲哚乙酸氧化酶(IAAO)、吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)和玉米素核苷(ZR)采用酶联免疫吸附双抗体一步夹心法(ELISA)检测[13]。试验重复3次，取平均值进行统计分析。

1.3 数据分析与处理

使用Excel 2007整理数据、SPSS 19.0软件进行数据统计分析，采用Tukey法进行多重比较，显著水平设置为α= 0.05；制图用OriginPro 8软件完成。

2 结果与分析

2.1 威宁短柱油茶插穗生根过程中形态学变化

扦插15 d后，插穗基部切口处膨胀，插穗的皮层与木质部逐渐分开，并伴有少量白色的愈伤组织在插穗的皮层与木质部间(图1A)。扦插30 d后插穗基部出现明显的白色愈伤组织，瘤状突起明显，有些愈伤组织出现白色根突，插穗上部保留的叶芽膨大明显(图1B)。扦插50～60 d后插穗膨大的叶芽逐步伸长，长出嫩叶，插穗基部愈伤组织或皮层出现不定根，其数量在8根以下，根长1～2 cm(图1C)。扦插90 d时，插穗叶芽伸长成嫩枝，插穗基部不定根快速生长，数量明显增多，有侧根出现，长度达6 cm左右(图1D)。可见，威宁短柱油茶插穗扦插至生根耗时较长，从扦插到形成大量不定根时间需要约90 d。威宁短柱油茶插穗生根为混合型生根类型，即不定根既可以发生在皮层，也可以发生在愈伤组织，故可清楚地看到不定根从皮层或愈伤组织长出(图1E、F)，但愈伤组织生根数量明显比皮层生根数量多。

2.2 威宁短柱油茶插穗生根过程解剖学观察

威宁短柱油茶插穗茎横切面和其他植物茎横切面相似，均由表皮、皮层、维管束、髓共4部分组成。插穗半木质化枝条解剖结构显示，威宁短柱油茶茎中未有根原始体的存在，且皮层中有一圈明显连续的厚壁细胞(图2A)，表明威宁短柱油茶属于生根困难型植物。插穗扦插15～20 d时，在插穗基部皮层区域中可观察到排列紧凑，分裂性强的细胞群体(图2B)，这些细胞跟周围其他细胞存在较大的差异，在之前插穗切片中未观察到，可以推断这些细胞为诱发以后形成的根原基细胞。可见，威宁短柱油茶根原基的产生与皮层细胞有关。在后续发育过程中，根原基细胞不断出现分裂活动，整个细胞群体开始不断纵横拉伸，向外将表皮等其他类型的细胞挤到外端，向内与维管束相通，形成不定根。

2.3 威宁短柱油茶插穗生根过程中营养物质变化

处理组和对照组插穗可溶性蛋白和可溶性糖含量随扦插时间的推进均呈现“先降后升”的变化趋势，但可溶性蛋白和可溶性糖变化趋势稍有不同(图3)。可溶性蛋白在0～15 d内迅速下降，15 d后明显上升，到60 d时含量最高，对照组含量为14.37 μg/g，略比0 d时13.80 μg/g高0.57 μg/g，但处理组可溶性蛋白含量(19.77 μg/g)达到了0 d时含量1.43倍；可溶性糖含量在0～30 d内下降明显，30 d后又缓慢增加，到60 d时处理组(58.87 μg/g)和对照组(53.53 μg/g)可溶性糖含量都低于0 d含量(59.81 μg/g)。方差分析结果显示，在30 d后，处理组的可溶性蛋白和可溶性糖含量始终高于对照组，差异显著(P<0.05)。

2.4 威宁短柱油茶插穗生根过程中氧化酶活性变化

多酚氧化酶、过氧化物酶和吲哚乙酸氧化酶活性在生根过程中其变化趋势存在差异(图4)。PPO、POD 活性变化趋势一致，两种酶对照组和处理组的值均随扦插时间延长而“逐步升高”，而IAAO活性却呈现“先降低-后升高”趋势。扦插15 d后，插穗的PPO和POD 的活性急剧增加，到60 d时升至最高水平。IAAO活性在0～15 d先降低，而在15 d后开始明显升高，直至60 d 最高。在60 d内，处理组的 PPO、POD 含量始终高于对照组，差异显著(P<0.05)；IAAO含量在扦插后30 d后处理组的值始终高于对照组的值，差异显著(P<0.05)。

2.5 威宁短柱油茶插穗生根过程中内源激素含量变化

随着扦插时间的推移，威宁短柱油茶插穗内源激素含量均发生了变化，且变化趋势不一致(图5)。IAA含量随时间推移对照组和处理组均出现增加，在60 d内，处理组的 IAA含量始终高于对照组，差异显著(P<0.05)。ABA含量随扦插时间推移下降明显，0～30 d时，ABA处理组比对照组含量略高，但30～60 d时，处理组含量明显比照组低，差异显著(P<0.05)。GA和ZR变化趋势有相似性，即GA和ZR处理组均是在扦插前期时含量迅速降低(GA在15 d时降至最低，ZR在30 d时降至最低)，扦插后期含量迅速升高，而对照组均表现出“降低-升高-降低-升高”的双峰走势。

由威宁短柱油茶插穗生根过程中内源激素比例变化(表1)可见：IAA/ABA比值随扦插时间推移而逐步升高，每个时间节点处理组始终高于对照组，差异显著(P<0.05)；IAA/ZR比值在0～30 d内不管是处理组还是对照组比值都迅速升高，但在30 d后，处理组比值逐渐降低，而对照组的比值略有升高，从整个扦插时间(60 d)来看，除30 d外，处理组比值始终低于对照组比值，差异显著(P<0.05)；IAA/GA比值从15 d开始不管是处理组还是对照组的值都迅速升高，但对照组的值逐步升高后在60 d才开始下降，而处理组却呈现“升高-下降-升高-下降”趋势，从整个扦插时间(60 d)来看，处理组比值始终高于对照组比值，差异显著(P<0.05)。

表1 威宁短柱油茶插穗生根过程中内源激素比例变化

3 讨论与结论

3.1 讨论

威宁短柱油茶插穗扦插生根过程和大多数植物相似，根据其愈伤组织出现时间到大量不定根形成时间来划分，可将其分为愈伤组织的形成期(扦插0～15 d)、不定根的诱导期(扦插15～30 d)、不定根的发生期(扦插50～60 d)和不定根的伸长期(扦插60～90 d)。这和叶小萍等[14]观察软枝油茶插穗生根时期一致，但威宁短柱油茶发根时间稍微比软枝油茶早10 d。王改萍等[15]研究楸树(CatalpabungeiC.A.Mey.)扦插生根发育过程时发现，楸树插穗生根时期也分为4个时期—愈伤组织的形成时期(扦插3～7 d)、不定根的诱导时期(扦插7～18 d)、不定根的发生时期(扦插18～20 d)和不定根的伸长时期(扦插20 d)，其每个扦插发育时期均比威宁短柱油茶扦插发育时期短，这表明树种不同，插穗根系发育时间也不一致。植物插穗生根难易程度与其解剖学结构密切相关，插穗不定根产生的关键在于根原基是否能在茎内部产生和皮层中是否有连续的厚壁细胞[16-17]。如圆柏(Sabinachinensis(L.)Ant.)[18]、土豆(SolanumtuberosumL.)[19]、野葛(Puerarialobate(Willd.)Ohwi)[20]，这类植物枝条内存在潜伏的不定根原基并且无连续的厚壁细胞，只要给予适合的外部条件，就很容易生根。威宁短柱油茶茎内部没有潜在的不定根原基细胞，且皮层细胞中有一圈明显连续的厚壁细胞，属于生根困难型植物，因此扦插时需要使用外源激素(生根剂)帮助其诱导根原基形成和破除连续的厚壁细胞，才能使其扦插成功。这和叶小萍等[14]研究软枝油茶扦插生根结果一致。

营养物质是插穗产生不定根的必要条件，它为插穗在生根过程中提供所需的基本物质和能量[21]。本研究中可溶性糖和可溶性蛋白在处理组和对照组中其含量均表现出随扦插时间的推移“先降后升”的变化趋势。扦插前期为了促使茎内产生根原基细胞，插穗可溶性蛋白和可溶性糖开始生物降解，为插穗根原基的产生提供所需要的物质能量；当不定根形成后，不定根从扦插土壤中吸收到营养物质和水分，促使插穗不定芽的萌发和生长，营养物质积累量增加，所以扦插后期可溶性糖和可溶性蛋白含量增加明显。方差分析结果显示，可溶性蛋白在扦插15 d后、可溶性糖在扦插30 d后，处理组的可溶性蛋白和可溶性糖含量始终高于对照组，差异显著(P<0.05)，表明外源激素处理显著提高了插穗不定根形成时期可溶性蛋白和可溶性糖含量。这与叶小萍等[10]用外源激素处理油茶插穗提高了插穗体内可溶性糖含量的结果相似。可溶性糖与可溶性蛋白含量的增加，为插穗形成大量不定根提供充足的营养，促使插穗产生根原基细胞，提高生根率和缩短生根时间。

插穗基部酶活性与插穗生根有着密切的关联，其中影响最大的是多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)和吲哚乙酸氧化酶(IAAO)[22]。本研究中，在愈伤组织诱导阶段(0～15 d)，PPO和POD活性均上升，IAAO降低。表明高浓度的PPO和POD，低浓度IAAO有利于愈伤组织诱导；在15～60 d，PPO、POD、IAAO等3种酶活性均出现迅速增加，到60 d时达最大值。这表明威宁短柱油茶不定根诱导期、不定根形成期和不定根伸长期都需要高浓度的PPO、POD、IAAO。POD能够清除插穗内部不利于生根的自由基等容易损伤插穗的物质；PPO可以催化插穗内酚类物质氧化与IAA合成“IAA-酚酸复合物”(一种生根辅助因子)，可以促进不定根的形成和生长；IAAO能够调节植物体内IAA的含量来影响插穗不定根的诱导过程[23]。可见，在威宁短柱油茶插穗生根过程中，自由基的清除、“IAA-酚酸复合物”的形成和IAA的调节都必不可少。本研究的PPO、POD、IAAO酶活性变化趋势和谢一青等[9]研究小果油茶扦插酶活性变化趋势稍有不同，可能是油茶种类、扦插时间、扦插激素、扦插基质等原因造成的差异。

插穗不定根形成与植物激素密切相关已被众多研究所证实[23-26]。本研究中，随扦插时间的推移，IAA含量增加明显，ABA含量则是逐渐下降，GA和ZR在扦插前期时含量迅速降低，扦插后期含量迅速升高(GA在15 d后升高，ZR在30 d后升高)，表明在扦插前期(0～15 d)高浓度IAA和低浓度ABA、GA、ZR有利于愈伤组织形成，扦插后期(15～60 d)高浓度IAA、GA、ZR和低浓度ABA有利于不定根诱导和伸长。与对照相比，处理组的IAA含量始终高于对照组；ABA含量在扦插30～60 d时，处理组含量始终显著低于对照组(P<0.05)。表明外源激素提高了插穗中IAA、ZR和GA含量，降低了ABA含量，促进了不定根的形成。本研究结果与普通油茶和油茶栽培品种‘云油茶’系列扦插研究结果一致[27-28]。植物扦插生根在探讨激素含量变化时，还需研究其比值才能更能全面评价植物激素对不定根发育的效应[23]。王艳晶[29]研究发现，高IAA/ABA比值可促进国槐(SophorajaponicaLinn)插穗根原基的诱导和分化。王东光[30]研究结果表明，高水平的IAA/ZR有利于不定根的发生，IAA/ZR上升则有利于不定根的形成。表明高浓度IAA/ABA和IAA/ZR对植物扦插生根有显著影响。本研究结果与前人研究结果一致，在生根过程中威宁短柱油茶插穗的IAA/ABA和IAA/ZR比值较高。本研究中，IAA/GA随扦插时间推进处理组和对照组比值变化趋势不一致，但从整个扦插时间(60 d)来看，处理组比值始终显著高于对照组比值(P<0.05)，IAA/GA与插穗生根的关系是否密切，还需要更多研究来证实。

3.2 结论

威宁短柱油茶插穗从扦插到形成大量不定根耗时较长，约为90 d。插穗茎内部没有潜伏的不定根原基细胞，且皮层细胞中有一圈连续的厚壁细胞，属于生根困难型植物，需要外源激素处理才能诱导根原基细胞的产生和不定根的发生。插穗在扦插30 d后需要大量的可溶性糖和可溶性蛋白、高浓度的PPO、POD、IAAO酶活性、高含量的IAA、ZR、GA和低含量ABA、高比值的IAA/ABA、IAA/ZR等生理条件来促进不定根的诱导和发育。外源激素处理显著促进了插穗基部可溶性糖、可溶性蛋白的积累，提高插穗PPO、POD和IAAO等氧化酶活性，加速插穗营养物质代谢和细胞分裂；同时还增加了插穗IAA、ZR、GA含量和IAA/ABA、IAA/ZR比值，降低ABA含量，有效调节插穗内植物激素的平衡，为插穗的不定根诱导和形成提供有利条件。