miR-655-3p靶向KIF20A抑制人肺腺癌细胞系A549迁移及侵袭

杜雪梅，张运梅，周文婷，吕 宏

(成都市龙泉驿区第一人民医院 病理科， 四川 成都 610100)

肺腺癌是非小细胞肺癌最常见的组织学亚型，其死亡率较高，5年总生存率低于20%[1-2]。尽管近年来对于肺腺癌的诊断和治疗已经得到了改善，但肺腺癌患者的预后仍然很差[3]。因此，更好地了解肺腺癌发生的分子机制将有助于确定有效的治疗策略。据报道，miR-655-3p在头颈鳞状细胞癌组织及细胞系中低表达，上调其表达可抑制肿瘤细胞的增殖及侵袭[4]，而驱动蛋白家族成员20A(kinesin family member 20A，KIF20A)在肺腺癌组织中高表达，其表达水平与肺腺癌患者临床分期、T分期及N分期显著相关[5]。但miR-655-3p及KIF20A对肺腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响鲜有报道，因此，本研究旨在探索miR-655-3p对肺腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响以及可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞:人肺腺癌细胞系H460、A549、HCC-2935、H1299及人支气管上皮细胞系BEAS-2B(北京科瑞思搏生物科技有限公司)。

1.1.2 主要试剂:miR-655-3p模拟物(miR-655-3p mimics)及其阴性对照(miR-NC)、KIF20A siRNA(si-KIF20A)及其阴性对照(si-NC)、KIF20A过表达物(OE-KIF20A)及其阴性对照(OE-NC)(ThermoFisher Scientific公司)；CCK-8 试剂盒(Bio-Rad公司)；TransStart®Green qPCR SuperMix(TaKaRa公司)；MMP-2、MMP-9、KIF20A、p-ERK1/2、p-PI3K、p-AKT、ERK1/2、PI3K、AKT、β-actin兔多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理: H460、A549、HCC-2935、H1299、BEAS-2B细胞在含有10% FBS的RPMI1640培养基中培养。取对数增殖期的A549细胞，分组为：空白组、miR-NC组、miR-655-3p mimics组、si-NC组、si-KIF20A组、miR-655-3p mimics+OE-NC组、miR-655-3p mimics+OE-KIF20A组。

1.2.2 RT-qPCR检测A549细胞中miR-655-3p表达水平: 用Trizol提取总RNA，反转录为cDNA后，使用SYBR Green PCR Master Mix进行RT-qPCR。用U6作为内部参照，通过2-ΔΔCt检测miR-655-3p表达。引物序列：miR-655-3p-F：5′-CCGCGATAATAC ATGGTTAACCTC-3′，miR-655-3p-R：5′-ATCTCGAGG CAGGGAGAGAGAGATAA-3′；U6-F：5′-GCCCATCTT GACCCGAAT-3′，U6-R：5′-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3′。

1.2.3 Western blot检测A549细胞中蛋白表达: 用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法进行定量后，通过10% SDS-PAGE电泳分离等量的蛋白质，并转移到PVDF膜上，封闭PVDF膜1 h后，加入一抗KIF20A、MMP-2、MMP-9、p-ERK1/2、p-PI3K、p-AKT、ERK1/2、PI3K、AKT、β-actin，在4 ℃下孵育过夜。然后加入HRP标记的羊抗兔二抗在室温下孵育1 h。通过Image J软件评估蛋白的吸光度值。

1.2.4 CCK-8 法检测A549细胞增殖: 按照1×103个/孔接种细胞于96孔板中。培养48 h后，加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃孵育2 h。酶标仪测定450 nm处的吸光度。

1.2.5 Transwell小室法检测A549细胞迁移与侵袭: 迁移实验，在Transwell上腔室中加入不含FBS的培养液，下室加入含FBS的培养液。37 ℃、5% CO2条件下孵育24 h后，甲醛固定细胞并用结晶紫染色后，在倒置显微镜下随机选择6个视野观察并计数。

侵袭实验，除在Transwell小室中预先加入Matrigel外，其他步骤与迁移实验相同。

1.2.6 双荧光素酶报告基因实验验证miR-655-3p与KIF20A的靶向关系: 分别构建KIF20A的野生型(WT)和突变型(MUT)3′-UTR区质粒，记为WT-KIF20A、MUT-KIF20A。将质粒分别与miR-NC或miR-655-3p mimics共转染于A549细胞，转染48 h后，使用双荧光素酶试剂盒测定荧光素酶活性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-655-3p在肺腺癌细胞系中的表达

与BEAS-2B细胞比较，H460、A549、HCC-2935、H1299细胞中miR-655-3p表达水平显著降低(P<0.05)，且miR-655-3p在A549细胞中的表达量最低，因此，选用A549细胞进行后续研究(图1)。

*P<0.05 compared with BEAS-2B group图1 miR-655-3p在不同肺腺癌细胞系中的表达Fig 1 Expression levels of miR-655-3p in different lung adenocarcinoma cell n=6)

2.2 过表达miR-655-3p对A549细胞增殖、迁移、侵袭的影响

与空白组和miR-NC组比较，miR-655-3p mimics组miR-655-3p表达显著升高，细胞增殖、迁移、侵袭及MMP-2、MMP-9蛋白表达显著降低(P<0.05)(图2)。

2.3 miR-655-3p靶向调控KIF20A的表达

使用targetscan预测miR-655-3p与KIF20A的结合位点(图3A)。双荧光素酶报告基因显示，与miR-NC+WT-KIF20A组比较，miR-655-3p mimics+WT-KIF20A组荧光素酶相对活性显著降低(P<0.05)(图3B)。miR-655-3p mimics组KIF20A蛋白表达水平显著低于空白组和miR-NC组(P<0.05)(图4)。

2.4 下调KIF20A表达对A549细胞增殖、迁移与侵袭的影响

与空白组和si-NC组比较，si-KIF20A组KIF20A、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平、细胞增殖、迁移、侵袭显著降低(P<0.05)(图5)。

2.5 过表达miR-655-3p或沉默KIF20A对RAS蛋白(rat sarcoma protein，RAS)/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路相关蛋白表达的影响

与空白组和miR-NC组比较，miR-655-3p mimics组p-ERK1/2、p-PI3K、p-AKT蛋白表达显著降低(P<0.05)；与空白组和si-NC组比较，si-KIF20A组p-ERK1/2、p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平显著降低(P<0.05)(图6)。

2.6 过表达KIF20A可抑制上调miR-655-3p表达对A549细胞迁移与侵袭的影响

与miR-655-3p mimics组和miR-655-3p mimics +OE-NC组比较，miR-655-3p mimics+OE-KIF20A组KIF20A、MMP-2、MMP-9蛋白、细胞增殖、迁移、侵袭显著升高(P<0.05)(图7)。

2.7 过表达KIF20A可抑制上调miR-655-3p表达对A549细胞中RAS/MAPK通路相关蛋白表达的影响

与miR-655-3p mimics组和miR-655-3p mimics +OE-NC组比较，miR-655-3p mimics+OE-KIF20A组p-ERK1/2、p-PI3K、p-AKT蛋白表达显著升高(P<0.05)(图8)。

*P<0.05 compared with blank group; △P<0.05 compared with miR-NC group图2 过表达miR-655-3p对A549细胞中miR-655-3p表达(A)、细胞增殖(B)、迁移与侵袭(C，D)的影响

3 讨论

miRNA在肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移过程中扮演着重要的角色。例如，miR-655-3p通过靶向RAB1A抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移[6]；miR-655-3p在非小细胞肺癌中低表达，过表达miR-655-3p通过靶向下调PTTG1的表达，进而抑制非小细胞肺癌的迁移和侵袭[7]。本研究发现，miR-655-3p在肺腺癌H460、A549、HCC-2935、H1299细胞中低表达，且miR-655-3p在A549细胞中的表达量最低，因此，选用A549细胞进行后续研究。本研究还发现，过表达miR-655-3p可抑制A549细胞的增殖、迁移与侵袭。据报道，MMP-2和MMP-9属于明胶酶类，在多种肿瘤组织中可检测到MMP-2的激活，激活的MMP-2则促进MMP-9活化，从而促进肿瘤的侵袭和转移[8]。本研究发现过表达miR-655-3p可抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表达，再次验证了过表达miR-655-3p可抑制细胞的迁移与侵袭。提示miR-655-3p在A549细胞中发挥着抑癌基因的作用。

A.the prediction result of targetscan; B.the verification result of dual luciferase reporter gene; *P<0.05 compared with miR-NC+WT-KIF20A group图3 miR-655-3p靶向调控KIF20A的表达Fig 3 miR-655-3p targeted regulation of KIF20A

*P<0.05 compared with blank group;△P<0.05compared with miR-NC group图4 Western blot检测KIF20A蛋白表达Fig 4 Western blot was used to detect KIF20A

*P<0.05 compared with blank group;△P<0.05 compared with si-NC group图5 下调KIF20A表达对A549细胞增殖(B)、迁移与侵袭(A，C)的影响

A.blank group; B.miR-NC group; C.miR-655-3p mimics group; D.si-NC group;E.si-KIF20A group; *P<0.05 compared with blank group;△P<0.05 compared with miR-NC group;▲P<0.05 compared with si-NC group

*P<0.05 compared with miR-655-3p mimics group;△P<0.05 compared with miR-655-3p mimics+OE-NC group图7 过表达KIF20A可抑制上调miR-655-3p表达对A549细胞增殖(B)、迁移与侵袭(A，C)的影响

A.miR-655-3p mimics group;B.miR-655-3p mimics+OE-NC group;C.miR-655-3p mimics +OE-KIF20A group; *P<0.05 compared with miR-655-3p mimics group; △P<0.05 compared with miR-655-3p mimics+OE-NC group

KIF20A可参与有丝分裂纺锤体的形成和染色体的分区等不同的细胞过程[9]。最近的研究表明，KIF20A在膀胱癌组织中高表达[10]，其高表达与患者的预后差显著相关；沉默KIF20A可抑制非小细胞肺癌的迁移、侵袭和增殖[11]。本研究发现，miR-655-3p靶向负调控KIF20A的表达；下调KIF20A表达可抑制A549细胞的增殖、迁移与侵袭能力；上调KIF20A抑制了过表达miR-655-3p对A549细胞增殖、迁移与侵袭的影响。

RAS-MAPK通路可调控肿瘤细胞的增殖，据报道RAS与细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signa1 regulated kinase,ERK1/2)结合可诱导细胞增殖，同时导致磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyl-inositol 3 kinase，PI-3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)蛋白的磷酸化[12-13]。本研究结果显示，过表达miR-655-3p或沉默KIF20A可抑制RAS-MAPK通路下游蛋白ERK1/2、PI3K、AKT的磷酸化水平，上调KIF20A抑制了过表达miR-655-3p对A549细胞中ERK1/2、PI3K、AKT蛋白磷酸化的影响，提示过表达miR-655-3p通过靶向下调KIF20A抑制肺腺癌细胞增殖、迁移及侵袭，该机制可能与抑制RAS/MAPK通路有关。

综上所述，过表达miR-655-3p通过靶向下调KIF20A，抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭，该机制可能与抑制RAS/MAPK通路有关。