多组学分析发现LAMC2是调节泛癌微环境的关键因子

苏路瑛，黄 容，邹定峰，许 富，李 凯，卢 艳，缪时英，王琳芳，宋 伟

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学分子生物学国家重点实验室, 北京 100005)

层黏连蛋白γ2(γ2 laminin, gamma 2，LAMC2)与其他两条链一起组成了多黏连蛋白-332。LAMC2位于染色体1q25-q31上[1]。LAMC2作为一个配体蛋白，它通过调节肿瘤微环境与其几个细胞表面受体ITGA3(integrin subunit alpha 3)、ITGA6(integrin subunit alpha 6)、ITGB1(β1-integrin)、ITGB4(integrin subunit beta 4)、ITGA2(integrin subunit alpha 2)、CD151(CD151 antigen)、COL17A1(collagen type ⅩⅦ alpha 1 Chain)的相互作用来驱动肿瘤发生。它可能作为抑制肿瘤发生的潜在抗癌治疗靶点。LAMC2高表达往往与人类肿瘤的总生存率差、早期复发和转移相关。它会影响正常细胞以及肿瘤细胞的分化、迁移和黏附，以及表型和存活[2-4]。并且LAMC2可能作为侵袭性肿瘤的特异性标志物[2, 5]。

尽管研究显示，LAMC2在多种肿瘤中均有促癌的作用。但仍缺乏泛癌相关分析。因此，本研究运用多种数据库对LAMC2的功能进行了系统分析，利用多组学数据证明LAMC2是影响患者肿瘤发生和临床预后的关键分子，也是泛癌微环境中的关键调控因子。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验对象：将2018年9月1日至2020年12月31日就诊于中国医学科学院肿瘤医院肝胆外科的4例胰腺癌患者作为本次研究对象，本课题入组患者的入选均为病理确诊为胰腺癌患者，签署知情同意书并接受手术治疗。年龄在48～75(63.72±7.27)岁。 本研究通过经国家肿瘤中心/肿瘤医院伦理委员会、中国医学科学院、北京协和医学院审核(21/197-2868号)。

1.1.2 主要试剂：自发荧光淬灭剂、488山羊抗小鼠荧光二抗、CY3标记山羊抗兔荧光二抗、含DAPI封片剂(均Servicebio公司)，LAMC2一抗(Abcam公司)，CD151一抗(Immunoway公司)。

1.2 方法

1.2.1 LAMC2表达的泛癌分析：使用TCGA门户网站GEPIA2(http://gepia2.cancer-pku.cn/)分析TCGA基因表达数据[6]。使用GEPIA2获取TCGA的32种肿瘤类型的RNAseq测序数据和配套的临床信息，进行不同癌组织与癌旁组织差异基因的分析，并且根据肿瘤分期、分级、患者种族、体质量及其他各种临床病理特征分组，依据分组计算LAMC2基因表达量。所有的表达量数据都进行对数转换，并以每个数组的中位数为中心，进行标准差归一化。图中红色代表肿瘤样本LAMC2的RNA表达量，蓝色代表正常样本LAMC2的RNA表达量。

1.2.2 LAMC2在肿瘤单细胞测序中的表达研究：单细胞测序技术通常用来解析肿瘤微环境中细胞组分与互作情况，从而筛选出肿瘤潜在的治疗靶点。因此使用TISCH(http://tisch.comp-genomics.org/)分析不同肿瘤单细胞测序数据[7]。挖掘LAMC2在单细胞数据中的主要表达细胞群及表达量并进行可视化。在UMAP图中用灰色至蓝色表示每个细胞LAMC2的表达量。

1.2.3 LAMC2的细胞表达位置分析：使用Reactome、Ensembl、Gene Ontology分析LAMC2在细胞上的表达位置，并使用swissbiopics(https://www.swissbiopics. org)在线作图工具作图。

1.2.4 LAMC2蛋白表达量：使用HPA(human protein atlas)(https://www.proteinatlas.org)数据库检索LAMC2在各种肿瘤组织及正常组织中亚细胞中定位、在各组织中的表达情况以及免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)染色结果。使用Prism 7 formac软件(SanDiego，CA，USA)对数据库中不同肿瘤组织IHC阳性程度进行统计。

1.2.5 LAMC2蛋白组学表达数据：登录到交互式网络资源UALCAN门户网站( http：//ualcan.path. uab. edu/analysis-prot.html)[8]，并应用“CPTAC分析”模块研究蛋白表达水平。在每个蛋白质组学谱中，CPTAC数据库将记录的表达值归一化到与中位数的标准差。通过检索“LAMC2”,比较肿瘤和正常组织中LAMC2总表达水平。选取10种肿瘤的现有数据集，包括卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、透明细胞肾细胞癌、肺腺癌和胰腺癌等。

1.2.6 LAMC2胰腺癌组织石蜡切片免疫荧光：提前一晚将石蜡切片放置于50 ℃烘箱中，让石蜡融化后将胰腺癌石蜡切片梯度脱蜡。随后组织切片置于盛满乙二胺四乙酸(EDTA)(pH=8.0)抗原修复液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复15 min。待玻片自然冷却，将玻片洗涤后用组化笔在组织周围画圈，加入自发荧光淬灭剂5 min，并用流水冲洗。在组画笔圈内滴加5%的牛血清白蛋白(BSA)，于室温封闭30 min。使用PBS缓冲液(pH=7.4)将LAMC2抗体按1∶200稀释，LAMC2的受体CD151按1∶100稀释。滴加抗体至玻片上，4 ℃孵育过夜。玻片洗涤甩干后在圈内滴加一滴按1∶500配制的488山羊抗鼠与594山羊抗兔荧光二抗覆盖组织，避光室温孵育60 min后洗涤。最后玻片用含DAPI的封片剂封片，盖上盖玻片。待玻片干透后，切片于荧光显微镜下观察并采集图像。

1.2.7 肿瘤免疫微环境分析：使用TIMER(https:// cistrome.shinyapps.io/timer/)进行不同肿瘤的LAMC2表达量与免疫细胞组分浸润分析[9]。

2 结果

2.1 LAMC2的RNA表达情况

分析LAMC2在TCGA不同肿瘤类型癌组织与正常组织中的表达量(图1)。LAMC2在大多数肿瘤组织中的表达水平均显著升高(P<0.05)，其中包括膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BLCA)，宫颈鳞癌和腺癌(cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma，CESC)，弥漫性大B细胞淋巴瘤(lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma，DLBC)，结肠癌(colon adenocarcinoma，COAD)，食管癌(esophageal carcinoma，ESCA)，头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSC)，肾乳头状细胞癌(kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP)，肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)，肺鳞癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)，卵巢浆液性囊腺瘤(ovarian serous cystadenocarcinoma，OV)，胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma，PAAD)， 前列腺癌(prostate adenocar-cinoma，PRAD)，直肠腺癌(rectum adenocarcinoma，READ)，胃腺癌(stomach adenocarcinoma，STAD)，睾丸生殖细胞癌(testicular germ cell tumors，TGCT)，甲状腺癌(thyroid carcinoma，THCA)，胸腺瘤(thymoma，THYM)，子宫体内膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC)，子宫癌肉瘤(uterine carcinosarcoma，UCS)。只有在肾嫌色细胞癌(kidney chromophobe，KICH)，肾透明细胞癌(kidney renal clear cell carcinoma，KIRC)，皮肤黑色素瘤(skin cutaneous melanoma，SKCM)这3种肿瘤中与相邻的正常组织相比，LAMC2在肿瘤的表达量显著低于正常组织(P<0.05)。

Dotplot of genes expression in different tissue; tumor names in red indicate high gene expression; tumor names in green indicate low gene expression

热图表示每种肿瘤组织中LAMC2的表达量(图2A)，红色越深，代表表达量越高。其中，在基底细胞癌(basal cell carcinoma,BCC)，胆管癌(cholangiocarcinoma,CHOL)，结肠癌(colon cancer,CRC)，头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSC)，非小细胞型肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，卵巢浆液性囊腺癌(ovarian serous cystadenocarcinoma，OV)，胰腺癌(pancreatic adenocar-cinoma，PAAD)中主要在恶性肿瘤细胞中表达。单独选用这几种肿瘤进行分群(图2B)，其中蓝色越深代表LAMC2表达量越高。结合Bulk RNA-seq与单细胞测序数据，发现LAMC2在结肠癌(CRC)、胆管癌(CHOL)、头颈鳞状细胞癌(HNSC)、非小细胞型肺癌(NSCLC)、卵巢癌(OV)和胰腺癌(PAAD)中是一个与肿瘤恶性潜在相关的基因。

2.2 LAMC2的蛋白表达情况

观察到LAMC2既可作为分泌蛋白，也可作为膜蛋白，它分布在细胞的胞外区域或基底膜，细胞膜等位置上(图3A)。

检测了数据库中44例正常组织的LAMC2蛋白表达(图3B)。LAMC2蛋白在阑尾、乳房、支气管、结肠、子宫内膜、输卵管、鼻咽、扁桃体中均有中等水平表达，但在肾上腺、骨髓、尾状、小脑、大脑皮层、子宫颈、十二指肠、附睾、食道、胆囊、心肌、海马体、肾脏、肝、肺、淋巴结、口腔黏膜、卵巢、胰腺、甲状旁腺、胎盘、前列腺癌、直肠、精囊、皮肤、小肠、平滑肌、软组织、脾、胃、睾丸和阴道中均未见表达。

A.LAMC2 expression in single cell sequencing data of human pan-carcinomatous tissues; B.expression of LAMC2 in single cell sequencing data of several human cancer tissues

A.expression of LAMC2 in human cells; B.expression intensity of LAMC2 protein in normal human tissues; C.LAMC2 protein expression ratio in human tumor tissues

LAMC2蛋白在大多数胰腺癌、皮肤癌、肺癌、卵巢癌、子宫颈癌、胃癌、甲状腺癌、头颈部癌、移行细胞癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌患者中表达。在前列腺癌、睾丸癌、良性肿瘤、肝癌、乳腺癌中均观察到弱至中度的细胞质免疫反应性(图3C)。在神经胶质瘤、肾癌、黑素瘤、淋巴瘤组织中均呈阴性染色。根据HPA数据库中免疫组织化学的结果，发现胰腺癌与皮肤癌在癌组织中的表达量远高于癌旁的表达量(图4A,B)。选用了4例胰腺癌患者的胰腺癌组织石蜡切片进行免疫荧光染色验证其在胰腺癌上的表达水平(图4C)，其中绿色为LAMC2,红色为LAMC2的受体CD151，蓝色为DAPI。

最后，蛋白组学数据显示，与正常组织相比，原发性乳腺癌、胰腺癌、子宫内膜癌和头颈癌中总蛋白的表达水平增强(图4D)。

2.3 多种肿瘤中LAMC2表达量与预后的关系

对TCGA中所有种类的肿瘤患者的预后进行了总生存期(overall survival,OS)分析。LAMC2高表达水平与较差的OS相关(图5)。

2.4 LAMC2与免疫浸润

肿瘤浸润性免疫细胞是肿瘤微环境的主要组成部分，对肿瘤的发生、进展或转移均有重要作用。因此，评估各种肿瘤中LAMC2基因表达与不同免疫细胞浸润水平之间的潜在相关性(图6)。通过研究发现，在结肠癌(COAD)、前列腺癌(PRAD)和直肠腺癌(READ)中观察到LAMC2表达水平与浸润CD8+T细胞水平呈正相关(rCOAD=0.258，rPRAD=0.216，rREAD=0.401，P<0.05) 。在结肠癌(COAD)，前列腺癌(PRAD)，甲状腺癌(THCA)中与CD4+T细胞水平呈正相关 (rCOAD=0.281，rPRAD=0.1，rTHCA=0.568，P<0.05)。并且这几种肿瘤也与其他免疫细胞例如B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞水平相关。从分析中可以看出，LAMC2表达与免疫细胞浸润之间的相关性模式在不同的肿瘤中明显不同。因此LAMC2可能通过调节肿瘤微环境中的成分和免疫机制来影响抗肿瘤免疫。

A.expression intensity of LAMC2 protein in human tumor tissuesdatabase was measured by immunohistochemistry staining; B.immunohistochemistry of LAMC2 in several human tumortissuesand corresponding normal tissues; C. immunohistochemistry of LAMC2 in several human neoplasms and corresponding normal tissues; D. proteomics data of LAMC2 in several human tumor tissues and corresponding normal tissues

3 讨论

目前，肿瘤仍是全球范围内重要的公共健康安全问题，治疗方式主要以手术、化疗、放疗以及药物为主。目前提倡个体化精准治疗，从而研发了很多分子靶向药物，分子靶向药物有疗效显著，副作用小等优点。但是肿瘤异质性极大制约着肿瘤精准治疗。肿瘤异质性内在体现为分子表达谱的差异，外在表现为患者预后、复发等区别。目前肿瘤的精准治疗由于存在肿瘤异质性问题，导致很多分子靶向药疗效个体差异较大，所以急需找到一个在患癌人群中广泛适用的靶向药物靶点。

图5 LAMC2的表达与泛癌患者总生存期(OS)的相关性Fig 5 Correlation between LAMC2 expression and overallsurvival(OS) in patients with generalized carcinoma

以往文献报道LAMC2在多种肝细胞癌和肺鳞状细胞癌中过表达[2]。并且证明了LAMC2蛋白在胰腺、胃、舌、膀胱、阴道、宫颈、结直肠癌、肺癌、食管鳞癌以及黑色素瘤和间变性甲状腺癌(anaplastic thyroid cancer，ATC)中高表达[2]。本文通过TCGA数据库挖掘LAMC2的Bulk RNA-seq的RNA表达水平发现，LAMC2的RNA在多数肿瘤中表达显著高于癌旁组织(P<0.05)，并且通过单细胞数据解析了LAMC2在多种肿瘤中表达于恶性肿瘤细胞。因此推测LAMC2是与肿瘤恶性相关的基因。通过肿瘤免疫组织化学和蛋白质谱数据分析LAMC2的蛋白表达水平，证明其在多种肿瘤中表达量高于癌旁组织。并通过实验证明LAMC2在胰腺癌微环境中与其受体一起发挥作用。

另外， 通过分析LAMC2表达与患者临床预后间的关系，发现LAMC2的表达可能在部分肿瘤的预后中起重要作用。并且本研究解析LAMC2的基因改变和LAMC2的表达量与肿瘤免疫微环境中免疫细胞浸润直接的关系。

图6 LAMC2的表达与不同免疫细胞浸润的相关性Fig 6 Correlation between LAMC2 expression and different immune cell infiltration

本研究全面分析了LAMC2在多种肿瘤中的作用，证明了LAMC2是一种重要的致癌基因，可能是有效治疗肿瘤的重要靶点。通过研究，希望为LAMC2在人类肿瘤的发展、治疗和预后中的作用提供新的见解。