Tim-3/Galectin-9信号通路在消化道恶性肿瘤中的研究进展

王志远,高峰

【提要】 近年来，消化道恶性肿瘤的发病率逐年增高，并且逐渐向年轻化、低龄化发展，对人类健康造成极大危害。因此，积极、有效地治疗对改善患者预后有重要意义。T 细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域分子-3(Tim-3)与其配体半乳糖凝集素-9 (galectin-9)结合，通过抑制IFN-γ、TNF-α和IL-2的产生来抑制Th1、Th17和Tc1细胞介导的免疫反应，同时维持Treg细胞功能，以此发挥抗肿瘤免疫的负性调控作用。本文围绕Tim-3/Galectin-9通路改变肿瘤免疫微环境，导致肿瘤细胞免疫逃逸这一机制，对其在消化道恶性肿瘤的研究进展做一综述。

消化道恶性肿瘤的发生、发展是一个多因素、多阶段、多种分子参与的过程，患者机体免疫状态在其中发挥重要作用。因此，从免疫学角度探讨肿瘤的发病机制，对开展治疗及预后的评估具有重要意义。T 细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域分子-3(T cell immunoglobulin and mucin domain containing molecule-3,Tim-3)，是国际上新近发现的与程序性死亡受体-1(programmed death-1，PD-1)具有同等地位的抗肿瘤免疫的负性调控因子。半乳糖凝集素-9 (galectin-9)是Tim-3最早发现的配体，最初被鉴定为嗜酸性粒细胞趋化和活化因子，随后发现其可调节多种生物功能，如细胞聚集、黏附，以及肿瘤细胞的凋亡。Tim-3/Galectin-9的相互作用可能会改变肿瘤免疫微环境，导致肿瘤细胞的免疫逃逸。因此，本文就Tim-3/Galectin-9在消化道恶性肿瘤中的作用机制及研究进展做一综述。

1 Tim-3和Galectin-9功能与特点

1.1 Tim-3的功能与特点

Tim-3是Tim家族的一员，该家族由8个成员(Tim1-Tim8)组成，其中Tim-1、Tim-3和Tim-4在人体中被发现[1]。Tim-3是一种I型跨膜蛋白，在终末分化的CD4+T细胞亚群，如Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞和1型CD8+T细胞(Tc1)上表达，其在Th2细胞上不表达。随着研究的不断深入，发现它在B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞、肥大细胞和单核细胞上也有所表达[2-5]。Tim-3由一个N端细胞外免疫球蛋白可变结构域(IgV)构成，该结构域具有FG-CC′环和N链聚糖，一个含有O链糖基化的黏蛋白结构域的位点，一个包含柄状结构域的N链聚糖，一个跨膜结构域和一个含有酪氨酸磷酸化基序的细胞质结构域[6-8]。Tim-3有四种不同的配体。Tim-3与galectin-9的结合可抑制Th1介导的免疫反应，并诱导Tim-3+T细胞的凋亡。表达Tim-3的T细胞可以通过与另一种配体Ptdser结合来识别凋亡细胞，Ptdser在凋亡细胞上表达，但不能吞噬凋亡细胞。然而，表达Tim-3的树突状细胞，当与Ptdser结合时，可以识别和清除凋亡小体。另一种Tim-3配体HMGB1，与树突状细胞中表达的Tim-3结合后，能够抑制肿瘤源性核酸向核内体的运输，从而抑制模式识别受体(PPR)介导的对这些核酸的免疫反应。然而，表达Tim-3的T细胞与HMGB1的相互作用尚未明确。CEACAM1与T细胞上表达的Tim-3的相互作用抑制了T细胞的效应功能，有助于维持T细胞的耐受性。在Tim-3配体中，Galectin-9与Tim-3 IgV结构域的N链聚糖结合，而其他配体结合到IgV结构域中的独特裂隙结构被称为FG-CC′环。虽然Galectin-9和CEACAM1在IgV结构域的结合位点不同，但研究表明，它们诱导了相同的下游信号事件[8-9]。

1.2 Galectin-9的功能与特点

半乳糖凝集素是一种由碳水化合物识别域组成的可溶性蛋白(CRD)，它与β半乳糖结合[10]。根据CRD的数量，将半乳糖凝集素分为原型、串联重复序列型和嵌合型半乳糖凝集素[11]。Galectin-9是半乳糖凝集素超家族中“串联重复”型的成员，该家族由两个非同源的CRDs组成，由一个柔性肽连接子(长度为14～56个氨基酸)连接，在蛋白质-蛋白质相互作用、膜嵌入和CRDs的表达中发挥重要的作用[12]。该肽连接子包含一个金属蛋白酶位点，可以帮助Galectin-9分泌到细胞外基质中。Galectin-9在上皮细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞和巨噬细胞中高表达[10,13]。Galectin-9通过Tim-3/Galectin-9通路在嗜酸性粒细胞活化、血凝集和抗转移、凋亡、T细胞稳态和细胞因子产生、Treg和Th17细胞分化方面具有重要作用，使Galectin-9成为免疫应答的调节因子[14]。目前已经报道了四种具有Galectin-9亲和力的受体。在这些受体中，Tim-3是Galectin-9最具特征性的受体。Tim-3/Galectin-9相互作用在免疫系统中表现出抑制或刺激作用，这取决于表达Tim-3的细胞类型。正常生理状态下，在T细胞亚群(Th1、Th17和Tc1)和巨噬细胞上表达的Tim-3对Galectin-9结合具有抑制作用，而在NK细胞和树突状细胞上表达的Tim-3在与Galectin-9结合时表现出刺激作用。Galectin-9的其他受体还包括Dectin-1、4-1BB和CD40。Dectin-1在巨噬细胞上高表达，并与Galectin-9结合后发挥免疫抑制作用。此外，已知Galectin-9/CD40相互作用可以阻止CD40对CD4loCD40+效应T细胞的增殖和存活作用。Galectin-9与4-1BB结合，促进4-1BB的聚集，增强促炎途径和免疫应答[15]。

1.3 Tim-3/Galectin-9通路

PD-1等蛋白在它们细胞质尾部有一个抑制基序，与之不同，Tim-3在其细胞质尾部有5个酪氨酸残基。在5个酪氨酸残基中，Y265和Y272在Tim-3信号转导中发挥重要作用。Tim-3/Galectin-9之间的相互作用诱导了细胞质尾部Y265和Y272位点的磷酸化[16]，导致结合的HLA-B相关转录本3(Bat3)从细胞质尾部中释放，Bat3释放的Tim-3与Src家族蛋白激酶之一的Fyn结合，与Bat3共享相同的结合位点。Tim-3胞质尾部的Fyn募集，磷酸化糖鞘脂微域1(PAG)相关的磷蛋白，从而促进C′-末端c-Src激酶(Csk)的募集。然后Csk磷酸化Lck的C′-末端酪氨酸，从而负调控Lck的活性，导致T细胞功能的抑制。因此，Tim-3/Galectin-9信号通路介导了抑制T细胞增殖、减少细胞因子产生和可能导致T细胞死亡等事件(见图1)。Tim-3/Galectin-9的相互作用也会影响近端T细胞受体(TCR)信号通路，增强了免疫突触中酪氨酸受体磷酸酶CD45和CD148的聚集。受体通过吞噬酶CD45使Lck的酪氨酸残基Y505和Y394去磷酸化，并降低其催化活性。同样，CD148低磷酸化连接适配蛋白(LAT)和磷脂酶γ1 (PLCγ1)，抑制下游T细胞功能[17-18]。总之，Tim-3/Galectin-9的作用通过抑制IFN-γ、TNF-α和IL-2的产生来抑制Th1、Th17和Tc1细胞介导的免疫反应。在Treg中，许多研究报道了Tim-3/Galectin-9相互作用的下游效应，Tim-3/Galectin-9的相互作用被认为是维持和调节Treg的功能和发展的原因。在一项研究中，Tim-3/Galectin-9导致IL-10和TGF-β等细胞因子的过表达，这促进了CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的增殖，Treg的增殖进而抑制效应T细胞的活性[19]。Yan等[20]的研究表明，与CD4+Foxp3-T细胞相比，CD4+Foxp3+T细胞中Tim-3的表达显著升高(70%>20%)。他们还发现，Foxp3在肿瘤浸润性Tim-3+CD4+T细胞中表达，该细胞在肿瘤微环境中表现出Treg特性。一项使用CT26细胞进行的体外研究表明，50%的CD4+Foxp3+T细胞表达Tim-3，而只有10%的CD4+Foxp3-TILs表达Tim-3。还有报道称[21]，在B16黑色素瘤和CT26结肠癌中，Tim-3+Treg产生的IL-10及免疫抑制活性是Tim-3-Treg的两倍。此外，Treg也表达Galectin-9，可能与Th1/Th17细胞上表达的Tim-3结合，抑制T细胞介导的免疫，诱导Th1/Th17细胞凋亡。在肿瘤相关的Treg中，Tim-3作为一种标记物可过表达[20]。Tim-3+Treg在肿瘤组织中高表现，但在外周血中水平较低。Tim-3/Galectin-9相互作用可增强同种异体移植耐受发展中的免疫抑制功能。Tim-3/Galectin-9相互作用通过增加IL-10和TGF-β的分泌来增强Treg在肿瘤微环境(TME)中的免疫抑制活性。

图1 Tim-3/Galectin-9信号通路

2 Tim-3/Galectin-9通路与消化道肿瘤

Tim-3/Galectin-9通路的干扰会导致多种疾病的发生，如自身免疫性疾病、感染、肿瘤。大量研究表明，在急性髓系白血病(AML)、前列腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺细胞癌(ESCC)、胶质瘤、头颈部癌、黑色素瘤和肺腺癌中，Tim-3和Galectin-9水平升高。关于Tim-3/Galectin-9通路在消化道肿瘤中的研究也越来越受到学者们的关注，以期为肿瘤的治疗提供新的靶点。

2.1 食管癌

在Zhang等[22]的研究中，Tim-3在食管炎、低级别上皮内瘤变、早期食管癌及进展期食管癌组织中的表达平依次递增。且Tim-3表达与食管癌临床病理特征密切相关。TNM Ⅲ-Ⅳ期患者的Tim-3表达水平高于Ⅰ-Ⅱ的患者,有区域淋巴结转移的患者Tim-3表达水平高于无区域淋巴结转移的患者。这与Zheng[23]等的研究结论一致。另一项研究表明[24]，Tim-3在食管癌鳞状细胞癌中高表达，但在不同的组织学分型中，Tim-3的表达也存在差异。另外，Tim-3表达阴性的食管癌患者，其总生存期明显高于Tim-3阳性的患者，提示Tim-3可以作为食管鳞状细胞癌预后的独立危险因素。Galectin-9的水平与食管癌的TNM分期、有无淋巴结转移无相关性，体外细胞实验发现，Galectin-9表达水平的下调，可能与肿瘤的迁移、侵袭相关，因此，Galectin-9可能是通过与Tim-3的相互作用来影响食管癌的发生、发展及预后。同样，Hou等[25]认为，高Tim-3和低galectin-9表达水平与食管鳞癌患者的不良预后相关，然而Tim-3和galectin-9的表达水平并不能直接作为为食管鳞癌预后的独立指标，仍需要深入论证。

2.2 胃食管结合部腺癌

胃食管结合部腺癌是一类距离胃食管结合部近端及远端5 cm以内的肿瘤的总称，在临床中并不少见。根据与EGJ线相对位置的不同，其临床病理学分型可表现为食管癌、贲门癌或胃癌。有学者提出[26]，在胃食管结合部腺癌中，Tim-3主要在肿瘤组织浸润的免疫细胞中表达，而Galectin-9主要表达在肿瘤细胞的细胞质和细胞膜上。不同部位的肿瘤组织tim-3的表达水平也有所不同，而Galectin-9在肿瘤大小、侵犯血管神经的比例、TNM分期、肿瘤位置上表达的差异均无统计学意义。尽管胃食管结合部腺癌患者个体之间Tim-3/Galectin-9表达水平不同，但其生存预后却无明显差异，这与Tim-3/Galectin-9在单纯食管癌、胃癌中的报道有矛盾之处，建议大样本量、多中心研究进一步证实。

2.3 胃癌

Tim-3在胃癌T细胞中高表达，且T细胞的表达水平和衰竭程度在胃癌肿瘤组织中的肿瘤浸润淋巴细胞、胃癌患者外周血T细胞、正常人外周血T细胞依次递减[27]。还有报道称[28]，胃癌患者Tim-3主要在NK细胞和巨噬细胞上表达，在rhlL-12刺激下，Galectin-9激活Tim-3，促进IFN-γ的分泌。动物实验表明，随着肿瘤负荷的增加，外周血和胃癌肿瘤组织NK细胞和巨噬细胞表达Tim-3的水平也随之增加。T-bet在NK细胞调控Tim-3表达中发挥重要作用。阻断Tim-3，能够影响单核巨噬细胞分泌TNF-α，而不会影响Thl、Th2和Thl7。在另一项临床研究中[29]，77%(34/44)的胃癌患者Galectin-9 mRNA显著下调。而Galectin-9的异常表达已经出现在癌旁组织中。Galectin-9 mRNA的低水平表达与临床分期、肿瘤分期、细胞分化、淋巴结转移和患者生存率相关。提示Galectin-9的低表达参与了胃癌的肿瘤发生。而该项研究报道59%的患者胃癌组织中Tim-3 mRNA表达水平显著降低，但在25%的患者中Tim-3表达也高于正常。细胞实验显示Tim-3/Galectin-9在胃癌中无相关性。上述研究不乏矛盾之处，故Tim-3/Galectin-9通路在胃癌中的功能机制有待进一步研究。Jiang等[30]认为，Galectin-9在无淋巴管浸润、淋巴结转移和远处转移的患者中表达较高，Tim-3低表达与Galectin-9的高表达的患者生存率较高，Tim-3/Galectin-9联合表达是胃癌的独立预后标志物。这些研究结果都表明，Tim-3/Galectin-9通路可能在胃癌发生中发挥重要作用，甚至可以作为胃癌治疗的潜在靶点。

2.4 结直肠癌

结直肠癌患者(CRC) TILs的Tim-3表达水平也显著高于癌旁组织T细胞，这些结果都说明消化道肿瘤微环境可诱T 细胞表达Tim-3。Tim-3还能通过提高T细胞抗原受体信号转导通路导致T细胞衰竭[31]。CRC患者的Tim-3+PD-1+CD8+T细胞显著增高，且Tim-3+PD-1+CD8+T细胞分泌的干扰素IFN-γ显著低于Tim-3-PD-1-CD8+T细胞[32]；CRC手术后，Tim-3和PD-1也会下调细胞免疫的能力提示在CRC术前、术后，Tim-3+PD-1+T细胞代表的是一群功能障碍的T细胞，Tim-3和PD-1可用于评价患者术后的恢复情况。有研究报道[33]，galectin-9基因和蛋白在CRC中的表达均低于正常结直肠黏膜组织，同时，伴远处转移CRC的Galectin-9表达低于无远处转移CRC，说明Galectin-9低表达与结直肠癌的远处转移有关。还有学者提出[34]，galectin-9在结直肠癌HT29细胞凋亡中发挥促进作用，其作用机制与SHH信号通路激活受阻有关。Galectin-9在结直肠癌中可能发挥抑癌蛋白的作用，但对于其是具体通过何种方式靶向调控 SHH 信号通路尚不明确。

2.5 肝癌

Tim-3在肝细胞癌(HCC)中高表达，并与患者的生存率呈负相关。Tim-3 /Galectin-9信号通路介导HBV相关HCC患者T细胞的消耗。阻断Tim-3 /Galectin-9信号通路可显著改善T细胞的功能， 增加T细胞的增殖和细胞因子的分泌[35]。因此，阻断Tim-3/Galectin-9信号通路可能是未来治疗HBV相关肝癌的有效治疗途径。一些研究发现[36]，TLR配体脂多糖可抑制巨噬细胞中Tim-3蛋白的表达，并恢复部分细胞功能。这说明Tim-3的表达可能是由于TLRs及其下游信号通路的表达。此外，在HCC中，Tim-3蛋白调节M1巨噬细胞向M2巨噬细胞的转化，进一步抑制炎症反应。在体外培养的树突状细胞中，Galectin-9可以刺激Tim-3的表达，促进TNF-α的分泌[37]。这些结果都表明，Tim-3在免疫细胞的调控中起着复杂的作用。另外，肝脏炎症微环境中的HBV及IL-6可上调Tim-3表达，促进下游分子STAT3活化，上调的Tim-3同样可以活化NF-κB下游通路，上述机制都能改变肝癌炎症微环境，促进肝癌细胞增殖[38]。

2.6 胰腺癌

树突状细胞是功能最强大的专职抗原提呈细胞，而Tim-3对树突状细胞参与的肿瘤免疫起负性调节作用。有研究报道[39]，胰腺癌组织中，Tim-3在肿瘤浸润树突状细胞上的表达水平显著高于癌旁组织及外周血，提示Tim-3可能改变了胰腺癌肿瘤微环境。阻断胰腺癌细胞培养液上清中VEGF、IL-10和PGE2的表达，Tim-3的表达水平也明显下调，说明上述三种细胞因子可能参与了对Tim-3表达的调控。相关作用机制有待进一步论证。

表1 Tim-3/Galectin-9在消化道肿瘤中的表达

3 问题与展望

Tim-3/Galectin-9通路作为一个新兴的免疫检查点正在被人们熟知，通过这些研究能让我们更好地了解该通路的各种作用机制，但目前关于Tim-3/Galectin-9通路在消化道肿瘤中的研究还存在以下局限性：①大部分研究还停留在临床试验阶段，仅通过外周血、肿瘤组织、癌旁组织中Tim-3/Galectin-9的差异性表达来说明该通路与肿瘤的相关性稍显单薄，缺乏更强有力的实验依据支持；②即便是体外细胞实验及动物实验也十分有限，更缺乏质粒转染技术、RNAi 干扰技术、受体特异性阻断技术等完善的设计方案；③应从临床层面、分子层面联合检测T细胞亚群(CD4+和CD8+T细胞)、NK细胞、巨噬细胞上Tim-3/Galectin-9的表达水平，了解其在肿瘤相关免疫细胞中的分布特点，阐明其作用机制，增加结果的可信度。

综上所述，Tim-3在消化道肿瘤中普遍上调，而Galectin-9则反之，Tim-3/Galectin-9平衡的改变会影响肿瘤细胞的生长、免疫逃逸、凋亡、侵袭和转移，同样对患者的诊疗和预后有重要意义。大量研究显示，Tim-3/Galectin-9在消化道肿瘤的靶向治疗上具有巨大潜力，寻找其上游非编码RNA(lncRNA、mi-RNA)及其下游调控的多个靶基因也是我们今后研究的方向和重点[40-41]。因此，我们有理由相信抑制Tim-3与Galectin-9的相互作用是治疗多种消化道恶性肿瘤的新靶点，在不久的将来，一定会有更多的消化道肿瘤患者从中获益。