儿童原发免疫性血小板减少症miR-106b-5p的表达及其与T细胞的相关性研究

王文芳 王绪松 谭三阳 钟兰兰 陈江

（海口市妇幼保健院 1.检验科；2.儿科，海南海口 570100）

原发免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenia，ITP）是一种儿童常见的自身免疫介导的出血性疾病，可引起皮肤、黏膜、内脏出血，存在危及生命的风险［1］。尽管ITP为自限性疾病，但仍有一些患儿治疗效果不理想，容易发展为难治性或慢性ITP，因此，对参与ITP 发病的相关细胞因子进行探讨显得尤为重要。越来越多的研究认为，T细胞免疫因子的比例失衡、免疫抗体的产生及机体免疫系统的紊乱在ITP发病机制中发挥重要作用［2-3］。辅助性 T 细胞 17 （T helper cells 17，Th17）是Th 细胞的一个独特而重要的亚群，参与多项免疫应答，Th17的功能失调在ITP发病中起主要作用［4］。调节性T 细胞（T regulatory cell，Treg）是一种抑制性T细胞亚群，具有抑制T细胞的活化及分泌抑制性细胞因子的功能，可保持免疫系统对自身成分的耐受，在调节多种疾病的免疫反应中起到很大作用［5］。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）被定义为通过靶向转录因子和其他在细胞中作用的元件来控制基因表达的调节因子，在免疫细胞的发育、分化及凋亡中发挥作用，最终影响机体免疫系统的平衡状态［6］。有研究指出，miRNA 的异常表达与ITP 的发生发展、预后判断及临床疗效密切相关［7］。亦有研究认为，miRNA 通过调节Th17 及Treg 这些细胞的表达，导致Th17/Treg 比例失衡，在ITP 的发病机制中起至关重要的作用［8］。近期研究发现，miR-106b-5p 可调控机体多种免疫细胞的表达，在细胞免疫应答中起到关键性作用，并参与自身免疫性疾病的发生发展［9］。然而，关于 miR-106b-5p 在儿童 ITP 中的表达情况及其与T 细胞比例失衡的关系尚未清楚。因此，本研究通过检测儿童ITP治疗前、治疗后miR-106b-5p 的表达水平，分析其与Th17、Treg、Th17/Treg 的关系，初步探讨 miR-106b-5p 在儿童ITP发病及治疗中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取 2019 年 1 月至 2021 年 7 月在我院就诊的ITP 患儿 79 例作为 ITP 组，男 43 例，女 36 例，确诊年龄1～14岁，平均年龄（4.1±1.2）岁。纳入标准：（1）符合儿童ITP诊断标准：具有皮肤黏膜出血点、淤斑和/或脏器出血等临床表现，血小板计数＜100×109/L，脾脏不大等特征［10］；（2）均行骨髓细胞学检查，符合ITP骨髓象：骨髓巨核细胞增多或正常，伴有成熟障碍［10］。排除标准：（1）排除其他继发性血小板减少症，合并恶性肿瘤、血液系统疾病及自身免疫疾病；（2）不能配合本研究者。另招募自愿参与本研究的健康儿童40 例作为对照组，男24例，女16例，年龄2～14岁，平均年龄（4.2±1.4）岁。本研究通过我院医学伦理委员会批准，经研究对象监护人知情同意。

1.2 治疗方法

ITP 患儿均采用静脉注射用人免疫球蛋白治疗，每天400 mg/kg，使用3～5 d；每天分3 次口服泼尼松1.5～2 mg/kg（最大不超过60 mg/d），至血小板计数＞100×109/L 后稳定 1～2 周，最后进行药物减停。另给予抗感染、止血等对症支持治疗。

1.3 主要仪器与试剂

ABI7500 实时荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司），FACS Calibur 型流式细胞仪（美国Becton Dickinson 公司），TRIzol 试剂购自美国Invitrogen 公司，反转录试剂盒及PCR 试剂盒购自大连TaKaRa公司。鼠抗人CD4-FITC 单克隆抗体（简称单抗）、CD25-FITC单抗、Foxp3-APC单抗、APC/PE分别标记的同型抗体、CD3-PC 单抗、CD8-FITC 单抗、IL-17A-PE单抗、溶血素、RPMI1640培养液及其他相关试剂均购自美国Becton Dickinson公司。

1.4 标本采集及检测

1.4.1 标本采集 所有ITP患儿于治疗前、治疗后，以及健康儿童于体检时，均分别采集静脉血3 mL 置于肝素钠抗凝管中，-70℃保存待检。以3 500 r/min，离心半径12.5 cm，离心10 min 分离血浆。

1.4.2 miR-106b-5p 检测 应用 TRIzol 法提取外周血中总RNA，按照反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成，然后按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书进行各目的基因的实时荧光定量，引物序列：miR-106b-5p上游：5'-ATGCTATCTCATACGT‐GTCA-3'， 下 游 ： 5'-GATCCATAGTCGATCTG‐GAT-3'。使用荧光定量PCR仪进行检测，采用2-△Ct法计算miR-106b-5p 水平。PCR 总反应体系为20 μL：1 μL 引物及探针 Mix，10 μL TaqMan 通用混合物溶液，1.33 μL cDNA，7.67 μL 双蒸馏水。扩增条件：95℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸60 s，进行40个循环。

1.4.3 Th17 及 Treg 检测 取 100 μL 肝素钠抗凝血，用RPMI 1640 培养液稀释（1∶1 等体积），加入 2 μL 刺激剂，孵育 4～6 h 在 37℃恒温水育箱中，然后加 20 μL CD8-FITC 单抗和 20 μL CD3-PC 单抗混匀，加2 mL 红细胞裂解液混匀，离心5 min（1 500 r/min）弃上清。加250 μL 固定破膜剂，然后孵育、洗涤、离心，弃上清加100 μL wash buffer重悬细胞，加20 μL IL-17A-PE 单抗混匀，再洗涤1 次 （1 mL wash buffer），离心5 min（1 500 r/min）弃上清，加500 μL PBS 重悬细胞，上流式细胞仪检测Th17。另取100 μL 肝素钠抗凝全血，分别加20 μL CD4-FITC 单 抗 、20 μL CD25-FITC 单 抗 及2.5 μL Foxp3-APC单抗混匀，再加2 mL红细胞裂解液混匀，离心5 min（1 500 r/min）弃上清，加500 μL PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测Treg。

1.5 疗效评价

疗效评价参考《中国儿童原发性免疫性血小板减少症诊断与治疗改编指南（2021 版）》［10］中的相关标准，分完全有效（治疗后相隔7 d以上测定2次，血小板计数≥100×109/L，且无出血症状）、有效（治疗后相隔7 d 以上测定2 次，血小板计数≥30×109/L，为治疗前的2 倍以上，且无出血症状）、无效（治疗后相隔1 d以上测定2次，血小板计数＜30×109/L，或为治疗前的2 倍以下，或有出血症状）。

1.6 统计学分析

采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析。正态分布计量资料以均数±标准差（）表示，两组间比较采用两样本或配对t检验。不符合正态分布的计量资料以中位数（四分位数间距）［M（P25，P75）］表示，多组间比较采用Kruskal-WallisH检验，组内两两比较采用Nemenyi检验。计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson 相关分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ITP组和对照组基线资料比较

ITP组和对照组的年龄、性别、体重指数、过敏史、血红蛋白及白细胞计数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。ITP组血小板计数低于对照组（P＜0.001）。见表1。

表1 ITP组和对照组基线资料比较

2.2 ITP 组和对照组 miR-106b-5p、Th17、Treg 及Th17/Treg水平比较

ITP 组 miR-106b-5p、Th17、Th17/Treg 水平高于对照组，Treg水平低于对照组（P＜0.001），见表2和图1～2。

表2 ITP组和对照组miR-106b-5p、Th17、Treg及Th17/Treg水平比较 （）

表2 ITP组和对照组miR-106b-5p、Th17、Treg及Th17/Treg水平比较 （）

注：［ITP］原发免疫性血小板减少症；［Th17］辅助性T 细胞17；［Treg］调节性T细胞。

Th17/Treg 0.08±0.04 0.76±0.15 16.712＜0.001组别对照组ITP组例数40 79images/BZ_74_1284_2983_1726_3101.pngmiR-106b-5p 0.83±0.15 2.37±0.94images/BZ_74_1726_2983_1910_3101.pngTh17(%)0.60±0.24 2.18±0.62images/BZ_74_1910_2983_2061_3101.pngTreg(%)8.5±1.8 2.9±1.0

图1 ITP组和对照组Th17流式细胞检测图

图2 ITP组和对照组Treg流式细胞检测图

2.3 ITP 患儿治疗前后 miR-106b-5p、Th17、Treg及Th17/Treg水平比较

ITP患儿治疗后miR-106b-5p、Th17、Th17/Treg水平低于治疗前，Treg水平高于治疗前（P＜0.001），见表3。

表3 79例ITP患儿治疗前后miR-106b-5p、Th17、Treg及Th17/Treg水平比较 （）

表3 79例ITP患儿治疗前后miR-106b-5p、Th17、Treg及Th17/Treg水平比较 （）

注：［Th17］辅助性T细胞17；［Treg］调节性T细胞。

组别治疗前治疗后Th17/Treg 0.76±0.15 0.19±0.07 13.150＜0.001images/BZ_75_238_2274_629_2392.pngmiR-106b-5p 2.4±0.9 1.5±0.5images/BZ_75_629_2274_806_2392.pngTh17(%)2.2±0.6 1.1±0.4images/BZ_75_806_2274_987_2392.pngTreg(%)2.9±1.0 5.3±1.5

2.4 不同疗效ITP 患儿miR-106b-5p、Th17、Treg及Th17/Treg水平比较

完全有效组 miR-106b-5p、Th17、Th17/Treg 水平低于有效组和无效组，Treg水平高于有效组和无效 组 （P＜0.05）。 有 效 组 miR-106b-5p、 Th17、Th17/Treg 水平低于无效组，Treg 水平高于无效组（P＜0.05）。见表4。

表4 不同疗效ITP患儿miR-106b-5p、Th17、Treg及Th17/Treg水平比较 ［M（P25，P75）］

2.5 血浆 miR-106b-5p 表达水平与 Th17、Treg 及Th17/Treg的相关性

Pearson 相关分析显示，ITP 患儿血浆miR-106b-5p 表达水平与Th17、Th17/Treg 均呈正相关（分别r=0.730、0.816，均P＜0.001），与Treg 呈负相关 （r=-0.774，P＜0.001）。对照组血浆 miR-106b-5p表达水平与Th17、Treg及Th17/Treg均无相关性（P＞0.05）。见表5。

表5 血浆miR-106b-5p表达水平与Th17、Treg及Th17/Treg的相关性

3 讨论

儿童ITP是一种自身免疫性疾病，其特征是由于血小板清除增强和生成受损而导致血小板计数降低，其发生发展与机体免疫系统功能异常及巨核细胞异常有关［11］。Th17 和 Treg 细胞均为 CD4+T细胞亚型中的重要细胞。Li 等［12］研究发现，与健康对照组相比，ITP 患者外周血中miR-106b-5p 表达升高，miR-106b-5p通过诱导了Th17/Treg的免疫失衡，在ITP 的发展中起重要作用。但miR-106b-5p在儿童ITP中的表达情况尚未清楚。

本研究中 ITP 组 miR-106b-5p、Th17 及 Th17/Treg水平明显高于对照组，而ITP组Treg水平明显低于对照组，提示miR-106b-5p 在ITP 患儿中异常高表达，其可能通过调控Th17、Treg 及Th17/Treg来参与ITP 的发病过程。相关分析也显示，miR-106b-5p 表达水平与Th17、Th17/Treg 均呈正相关，与Treg呈负相关。提示miR-106b-5p的异常表达与Th17、Treg 及Th17/Treg 水平有重要联系，可能是导致ITP患儿Th17/Treg比例失衡的关键因素。Qian等［13］研究发现，ITP患者miR-106b-5p表达水平升高，参与ITP 发病和疾病进展过程，可能是ITP 有价值的潜在生物标志物。He等［14］研究证实，Th17与Treg 之间有重要联系，Th17/Treg 的不平衡可破坏机体免疫系统，导致细胞免疫功能失调，最终造成ITP发生。亦有研究认为，miRNA的异常表达可导致ITP 患者Th17/Treg 失衡，增加机体免疫反应和炎症损伤，进而参与ITP的发生发展，是一个新的治疗ITP的潜在靶点［15］。

本研究采用糖皮质激素与丙种球蛋白冲击治疗ITP，结果显示ITP 患儿治疗后miR-106b-5p、Th17、Th17/Treg 水平明显低于治疗前，Treg 水平明显高于治疗前；完全有效组miR-106b-5p、Th17、Th17/Treg 水平明显低于有效组和无效组，Treg水平明显高于有效组和无效组。说明在ITP患儿治疗过程中检测miR-106b-5p、Th17、Treg 及Th17/Treg水平，对ITP患儿的疗效判断具有较好的指导作用。由此推测丙种球蛋白冲击治疗可能通过抑制miR-106b-5p的表达，恢复Treg功能，纠正Th17/Treg 比例失衡，进而达到治疗ITP 的目的。Cheng 等［16］研究指出，ITP 患者 Th17 细胞及细胞因子增多，而Treg 细胞及细胞因子受到抑制，Th17/Treg比例失衡在ITP的发病中起重要作用，经免疫抑制治疗后Treg 细胞活性显著提高，Th17/Treg紊乱被纠正。另有研究表明，与健康对照组相比，ITP 患者的Treg 细胞及miRNA 的表达存在差异，miRNA通过调控Treg细胞参与ITP的免疫发病机制，miRNA 的功能丧失促进了免疫紊乱，可能为ITP的免疫靶向治疗带来新的思路［17］。

本研究的局限性在于单中心的临床研究、样本量较少、随访时间短，无法全面评估miR-106b-5p在ITP中的长期变化，今后仍有待进一步深入研究，并加以完善。

综上所述，ITP 患儿中血浆miR-106b-5p 异常高表达，其高表达与Th17/Treg 比例失衡有关，在ITP患儿治疗过程中检测miR-106b-5p、Th17、Treg及Th17/Treg 水平，对ITP 患儿的疗效判断具有较好的指导作用，提示miR-106b-5p 可能是儿童ITP的重要标志物及临床治疗的潜在靶点。