高浓度大气CO2对铅污染刺槐幼苗根际土壤有机化合物和微生物特性的影响

黄淑萍，王晓曼，许智恒，张中帅

(信阳师范学院 地理科学学院/河南省水土环境污染协同防治重点实验室，河南 信阳 464000)

0 引言

由于工农业快速发展和人类活动加剧，大气CO2浓度以每年0.45%的速率快速增加，据IPCC(2014)评估报告[1]，目前大气中CO2浓度约为385 μmol/mol，专家预测到2050年将上升到550 μmol/mol，21世纪末CO2浓度将达到700 μmol/mol。贾夏等[2]研究发现，高浓度大气CO2不仅影响土壤微生物功能及群落多样性变化，还可以影响土壤酶活性，高浓度大气CO2通过提高光合同化率而增加植物茎和根系生物量，改变植物根系分泌量，从而影响土壤理化性质和有机质含量，由此提高土壤肥力，为土壤微生物提供适宜的生长环境。与此同时，土壤重金属污染是另一个备受关注的环境问题，随着矿物燃料燃烧、污水灌溉和农药化肥的广泛使用，使得大量重金属输入到土壤生态系统中，土壤重金属污染状况日益加剧。其中铅(Pb)是环境中普遍存在且毒性很强的重金属污染物，严重威胁植物际土壤生态系统的安全性和稳定性，STEFANOWICZ等[3]研究发现，土壤Pb污染条件下土壤微生物及酶活性可能受到重要影响，会直接关系到植物根际土壤矿质和有机质元素的转化，影响根系对营养元素的吸收和利用，最终改变植物的营养状况及品质。高浓度大气CO2通过提高植物净初级生产力，导致有机化合物大量流入根际土壤，影响土壤中重金属生物利用度，从而影响微生物和植物对重金属的吸收利用。为此，在高浓度大气CO2和土壤重金属污染并存的情况下，对植物根际微环境的响应研究已成为近年来科研工作者关注的焦点。

根际微环境是在植物根系分泌和吸收两个动态过程作用下形成的，植物根系通过脱落物或产生分泌物为根际区土壤微生物提供有效碳源，微生物通过分解有机物质又可为植物提供营养，从而致使根际土壤与根外土壤的理化性质和生物学性征存在很大差异，呈现出一定的根际效应。目前已有大量关于植物根际微环境方面的研究报道，但这些研究多聚焦于单独高浓度大气CO2或单独土壤重金属污染条件下植物根际与非根际土壤有机质、微生物特征及土壤酶活性等方面[2-3]，由于现阶段全球高浓度大气CO2与土壤重金属污染问题是同时存在的，二者联合效应对植物根际微域的影响研究仍然缺乏，尤其是联合效应下植物根际微域中有机化合物和微生物特性之间的相关性关系仍有待研究。

鉴于此，本研究采用CO2开顶箱控制系统(Open top chambers，简称为OTCs)，对盆栽刺槐1年生幼苗进行高浓度大气CO2与土壤Pb污染联合处理试验，旨在探讨刺槐根际土壤生化特性变化及其相关性对两者环境因子联合作用的响应规律，为研究全球气候变化背景下重金属污染土壤生态系统的响应及反馈状况提供理论数据和参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验所用刺槐种子购于西北农林科技大学。供试土壤来源于陕西关中(34°16′N，108°54′E)地区，土壤类型为淋溶土棕壤。采用多点混合采样法采集0～20 cm层土壤，去除石子等较大杂物后过5 mm 筛并充分混匀，土壤基本理化性质见表1。

表1 供试土壤理化性质Tab. 1 The physical and chemical properties of the tested soils

1.2 试验设计

本试验采用裂区设计，主区因素：CO2浓度；副区因素：Pb，考虑交互作用。试验共设3对OTCs气室，其中3个为高浓度大气CO2处理气室，并在每个气室中嵌套2组Pb污染处理。依据“IPCC(2014)评估报告”[1]，在OTCs气室中由自动控制系统将高浓度大气CO2保持在700 ± 30 μmol/mol，对照CO2浓度约为385 ± 30 μmol/mol。各气室之间距离较远，彼此间小气候差异可忽略不计。在气室中随机排列重金属处理盆栽，根据国家《土壤环境质量标准》(GB 15618-1995)设置添加0 mg/kg和500 mg/kg 两种Pb浓度，最终形成15.6 mg/kg和515.6 mg/kg 两个Pb水平，分别记为Pb0和Pb500。本试验同一Pb水平设置9个重复，每个OTCs气室中(共6个)，放置Pb0、Pb500处理盆栽各3盆，因此，试验盆栽共计36盆。采用向土壤中添加外源污染物的方式，向土壤中加入Pb(NO3)2溶液以实现Pb污染，在添加外源污染物质前测定土壤含水量以准确得出重金属添加量，同时保证各处理盆栽土壤含水量相同，污染土壤平衡一个月后装盆，每盆装入25 kg土壤。于2015年5月1日播种刺槐种子，待出苗10 d后，根据生长状况，每盆选留40棵大小均匀且健壮的幼苗用作实验。每个盆中都装有土壤湿度传感器以进行土壤水分测定，设置为每小时读数一次，在整个试验期间根据土壤平均含水量采用自来水进行浇灌，确保土壤水分含量约为田间最大持水量的60%。盆栽中的杂草及幼苗落叶均被人工清理干净。本试验4个处理分别为：1)ACO2：对照组(385 μmol/mol + Pb0)；2)ECO2：高浓度大气CO2处理(700 μmol/mol + Pb0)；3)Pb：Pb污染处理(385 μmol/mol + Pb500)；4)ECO2+ Pb：高浓度大气CO2+ Pb污染处理(700 μmol/mol + Pb500)。

1.3 样品采集及测定方法

1.3.1 土壤取样方法

2016年5月(从播种开始试验处理满一年)开始采样，每个盆栽土壤样品即为1份土样，故同一Pb水平的土壤样品共计9份。每个盆栽布设3个取样点，即每个盆栽挖取3棵刺槐幼苗，采用抖落法获取根际土壤，再将3份根际土壤混合成1份，作为此盆栽的土壤样品。将挖取的整株植株抖掉根系外围土，剩余的即为根际土样，用毛刷刷下根表土，然后用镊子将细根及其他杂物移除，将土壤混匀分装好过2 mm筛，在4 ℃环境下保存并尽快地完成土壤理化指标和微生物特性的测定分析。

1.3.2 测定指标及方法

土壤pH值采用酸度计电位法测定，总有机碳(TOC)采用重铬酸钾外加热法测定，可溶性有机碳(DOC)采用TOC-Analyzer分析仪测定，总糖采用3,5-二硝基水杨酸法测定，酚酸采用福林酚比色法测定，氨基酸采用茚三酮比色法测定，有机酸采用FeCl3分光光度法测定。上述具体测试方法及步骤详见《土壤分析技术指南》[4]。土壤细菌、真菌、放线菌数量采用CFU菌落计数法[5]测定，微生物量碳(MBC)采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法[6]测定，总微生物活性(FDA)采用荧光素双醋酸酯法[7]测定。土壤脲酶采用苯酚钠比色法[8]、脱氢酶采用三苯基四氮唑氯化物(TTC)比色法[9]、转化酶采用3,5-二硝基水杨酸比色法[10]、β-葡萄糖苷酶采用以对-硝苯-β-葡萄糖苷为底物进行酶解，并于400～420 nm直接测定底物水解释放的配基对-硝基苯酚的方法[11]、L-天门冬酰胺酶采用奈氏试剂比色法[12]测定。

1.4 数据处理

运用Excel 2016进行数据处理，图表数据为平均值和标准误差(SE)，运用SPSS 19.0进行差异显著性分析(Tukey法，P<0.05)和相关性分析。采用Sigmaplot 12.5进行绘图，采用R软件进行冗余分析(RDA)。

2 结果与分析

2.1 高浓度大气CO2与Pb污染下土壤pH值及有机化合物变化

高浓度大气CO2和Pb污染对刺槐根际土壤有机化合物的影响结果如图1所示。

图1 高浓度大气CO2和Pb污染对刺槐根际土壤有机化合物的影响Fig. 1 Effects of elevated CO2 and Pb contamination on organic compounds in rhizosphere soils of Robinia Pseudoacacia L.

由图1可见，与对照大气CO2浓度(ACO2)相比，高浓度大气CO2(ECO2)使刺槐根际土壤TOC、DOC、MBC、总糖、酚酸、氨基酸和有机酸含量分别升高了9.39%、27.80%、4.57%、11.29%、17.36%、8.45%和6.22%。Pb污染使刺槐根际土壤TOC、总糖、氨基酸和有机酸含量分别增加了6.09%、12.13%、6.02%和13.51%，而使DOC、MBC和酚酸含量分别降低了26.30%、30.78%和7.57%。与单独Pb污染相比，ECO2+ Pb污染下土壤DOC、MBC、总糖、酚酸、氨基酸和有机酸含量分别提高了21.07%、23.61%、13.37%、15.03%、10.11%和7.14%，而TOC含量变化不显著。不同处理条件下刺槐根际土壤pH值无明显变化。

2.2 高浓度大气CO2与Pb污染下土壤微生物数量及活性变化

高浓度大气CO2提高了刺槐根际土壤微生物数量及活性(图2)。与对照组ACO2相比，ECO2处理下细菌、真菌、放线菌和微生物活性(FDA)分别提高了3.29%、3.76%、7.22%和9.54%。Pb污染下细菌和真菌数量较对照组ACO2下降了4.06%和4.53%，放线菌和FDA下降趋势较大，分别为12.86%和10.89%。与单独Pb污染相比，ECO2+ Pb污染下细菌、真菌、放线菌和FDA分别提高了1.29%、15.18%、4.65%和6.12%。由图2可知，高浓度大气CO2和Pb污染对土壤微生物特征呈相反效应，而在两环境因子联合作用下，刺槐根际土壤微生物数量及活性整体呈上升趋势，表明高浓度大气CO2提高了Pb污染土壤中微生物数量及活性。

图2 高浓度大气CO2和Pb污染对刺槐根际土壤微生物数量的影响Fig. 2 Effects of elevated CO2 and Pb contamination on microbial populations in rhizosphere soils of Robinia Pseudoacacia L.

2.3 CO2浓度升高与Pb污染下土壤酶活性变化

高浓度大气CO2下刺槐根际土壤酶活性呈不同的响应特征(图3)，ECO2处理下土壤脲酶、脱氢酶、转化酶、β-葡萄糖苷酶活性较ACO2处理分别增加了3.31%、8.47%、6.73%和5.71%，而L-天门冬酰胺酶活性下降了11.62%。与ACO2相比，Pb污染使土壤脲酶、脱氢酶、转化酶、β-葡萄糖苷酶活性分别降低了26.97%、12.94%、4.74%和16.98%，而使土壤L-天门冬酰胺酶活性升高了20.43%。ECO2+ Pb污染与单独Pb污染相比，土壤脲酶、脱氢酶、转化酶、β-葡萄糖苷酶活性分别提高了8.06%、13.58%、6.59%和7.85%，L-天门冬酰胺酶下降了14.56%，高浓度大气CO2与Pb污染对土壤酶活性表现出相反的效应，整体上除L-天门冬酰胺酶外，整体上两环境因子联合作用提高了刺槐根际土壤酶活性。

图3 高浓度大气CO2和Pb污染对刺槐根际土壤酶活性的影响Fig. 3 Effects of elevated CO2 and Pb contamination on enzyme activities in rhizosphere soils of Robinia Pseudoacacia L.

2.4 高浓度大气CO2与Pb污染下土壤有机化合物和微生物特性的动态关联

以土壤微生物特性为响应变量，土壤有机化合物为解释变量，对高浓度大气CO2和Pb污染条件下的根际土壤微生物特性进行冗余分析，得到排序图4。如图4所示，4种实验处理条件明显分开，A处理(对照)分布于上方中间位置，P处理(重金属)主要位于左上方，E处理(高CO2)主要分布在右侧位置，EP处理(高CO2+ Pb)分布在右下方，说明高浓度大气CO2与Pb污染使土壤有机化合物和微生物特性分布产生明显差异。RDA前两轴分别解释了微生物特性的65.83%和22.45%。图4蓝线代表土壤有机化合物，线段越长代表影响越显著，红线代表土壤微生物及酶活性，可见总糖、酚酸、MBC、 pH 值为根际土壤微生物特性的主要影响因子，而氨基酸、DOC、TOC对土壤微生物的影响较小；解释变量与响应变量之间夹角越接近0°代表正相关性越显著，夹角越接近180°代表负相关越显著。由图4可以看出，总糖、酚酸、MBC与细菌、放线菌、脲酶、转化酶、β-葡萄糖苷酶呈正相关关系，与L-天门冬酰胺酶呈负相关关系，土壤pH值与真菌、FDA呈正相关关系，该结果与相关分析(表2)的结果一致。

图4 土壤性状与土壤微生物特征的冗余分析(RDA)Fig. 4 Redundancy analysis (RDA) of relationship between soils indexes with soil enzyme activities

表2 土壤有机化合物与土壤微生物特征之间的相关性Tab. 2 Correlations analysis of soil organic compounds with soil microbial characteristic

3 讨论

3.1 高浓度大气CO2对Pb污染土壤有机化合物的影响

土壤有机化合物主要来源于植物枯枝落叶分解产物、根系脱落物以及植物根系分泌物等，由于试验期间随时清理盆栽中的杂草和植物落叶，因此本研究中刺槐根际土壤有机化合物变化主要与根系脱落物和根系分泌物等有关。高浓度大气CO2条件下刺槐根际土壤TOC、DOC、MBC、总糖、酚酸、氨基酸和有机酸含量升高，这表明高浓度大气CO2对根际土壤有机化合物含量增加有促进效果，主要是与高浓度大气CO2可促进植物生长、光合作用及根系生物量有关[13]，同时随着植物生长，更多的植物根系残体经微生物分解也会改变土壤有机化合物含量。Pb污染处理下根际土壤TOC、总糖、氨基酸和有机酸含量增加，而DOC、MBC和酚酸含量降低，表明根际土壤有机化合物对Pb污染呈不同的响应特征。本研究中Pb污染可能通过影响刺槐生长及根系状况，从而改变根系分泌特征，引起根际土壤有机化合物含量升高或降低。与单独Pb污染相比，高浓度大气CO2与Pb联合作用下土壤DOC、MBC、总糖、酚酸、氨基酸和有机酸含量显著提高，而土壤中TOC含量无明显变化，表明高浓度大气CO2促进了Pb污染土壤有机化合物含量增加。

3.2 高浓度大气CO2对Pb污染土壤微生物特性的影响

土壤微生物通过参与植物枯枝落叶以及动植物残体分解，对陆地生态系统营养元素的化学转化、物质循环等活动具有重要作用。土壤中CO2浓度约为大气CO2浓度的10～50倍，因此，升高的大气CO2主要通过影响植物从而间接作用于土壤微生物特性。XIAO等[14]研究表明，土壤细菌和真菌数量随大气CO2的升高而增加，HUANG等[5]通过8 a高原草原研究发现，高浓度大气CO2条件下土壤微生物量C、N以及微生物活性增加，分析表明微生物活性变化与土壤含水量差异无关，主要与根系分泌物增多导致的土壤C输入增加有关。与对照CO2相比，高浓度大气CO2下细菌、真菌、放线菌和FDA分别提高了3.29%、3.76%、7.22%和9.54%，表明高浓度大气CO2提高了刺槐根际土壤微生物数量及活性。因此，高浓度大气CO2通过提高土壤总糖、氨基酸和有机酸含量(图1)，为微生物生命活动提供了更多的有机底物，从而促进了土壤微生物生长。微生物是土壤酶的主要来源，高浓度大气CO2提高了刺槐根际土壤脲酶、脱氢酶、转化酶、β-葡萄糖苷酶活性(图3)，这主要与高浓度大气CO2条件下增加的土壤微生物数量和活性有关(图2)。本研究还发现高浓度大气CO2条件下L-天门冬酰胺酶活性有所降低，而XUE等[15]研究表明高浓度大气CO2提高了白羊草根系土壤蔗糖酶及脲酶活性，但是脱氢酶活性未见显著的变化，这表明土壤酶对高浓度大气CO2的响应差异可能与植物种类有很大关系。

Pb污染下放线菌和FDA下降，而细菌和真菌数量较对照组ACO2略有下降，且处理间差异不显著，JIA等[2]研究表明，Pb污染改变了植物根际土壤微生物群落结构，PAN等[16]研究棕壤微生物区系发现，Cd、Pb污染下土壤真菌数量无明显变化，而细菌、放线菌数量变化趋势较大，这与本研究结果有所差异，表明土壤微生物因重金属种类差异而表现出不同的响应特征。本研究发现Pb污染下土壤微生物数量及活性降低，这可能是由于土壤微生物通过带电荷的细胞表面吸附重金属离子或将其富集于细胞内部，而重金属与细胞内生物大分子比如酶活性中心的结合会导致微生物死亡[17]。Pb污染抑制微生物数量及活性，降低微生物产酶速率及分泌程度，从而间接引起刺槐幼苗根际土壤酶活性降低(图3)。另外，重金属可通过与酶分子活性部位-巯基和含咪唑的配体结合形成稳定的络合物，从而直接造成酶分子失活以降低土壤酶活性[18]。高浓度大气CO2和Pb污染对土壤微生物数量分别表现出促进和抑制效应，ECO2+ Pb联合作用下细菌、真菌、放线菌和FDA分别提高了1.29%、15.18%、4.65%和6.12%(图2)。整体上除L-天门冬酰胺酶外，两因子联合作用提高了根际土壤酶活性，表明高浓度大气CO2缓解了Pb污染对土壤微生物数量及活性的抑制效应，从而提高了Pb污染土壤中酶活性。

3.3 高浓度大气CO2与Pb污染下土壤有机化合物和微生物特性的动态关联

微生物作为陆地生态系统中最重要的生命组分之一，对土壤形成、有机质分解、土壤养分转化和循环等过程具有重要影响，是生物地球化学循环最核心的环节。外界环境引起的土壤微生态环境变化对微生物的生长繁殖具有重要作用，本研究通过对土壤有机化合物与微生物特征进行冗余分析，发现高浓度大气CO2、Pb污染会引起土壤有机化合物、微生物数量及活性、土壤酶活性等产生分布差异。本研究中总糖、酚酸、MBC和pH为影响土壤微生物特征的主要环境因子，夏建文等[19]发现土壤酶活性与土壤TN和MBC的变化趋势基本一致，TN和MBC是土壤胞外酶活性的关键决定因子。土壤微生物特征与有机化合物之间存在典型相关关系，本研究发现总糖、酚酸、MBC与细菌、放线菌、脲酶、转化酶和β-葡萄糖苷酶呈正相关，与L-天门冬酰胺酶呈负相关，表明土壤有机化合物和微生物特征之间存在显著的相关关系。植物在生长过程中有高达30%以上的光合产物以有机碳的形式进入到根际土壤，这些有机物质为土壤微生物提供丰富的碳源，促进根际微生物的生长。作为土壤酶的主要来源，土壤微生物变化能够引起酶活性的改变，微生物与土壤酶活性之间存在直接相关关系。另外，真菌、脱氢酶、FDA与土壤有机化合物之间的相关性不显著，表明不同种类土壤微生物与土壤有机化合物之间的关系有所差异。

4 结论

通过高浓度大气CO2对铅污染刺槐幼苗根际土壤有机化合物和微生物特性的影响研究，得到如下主要结论：

(1)高浓度大气CO2使刺槐根际土壤有机化合物、微生物和酶活性显著增加，而土壤pH值变化不显著。

(2)单独Pb污染提高了土壤TOC、总糖、氨基酸、有机酸含量及L-天门冬酰胺酶活性，降低了DOC、MBC和酚酸含量，对微生物数量及土壤酶呈抑制效应。

(3)高浓度大气CO2提高了Pb污染土壤有机化合物含量和土壤微生物特性表现为促进效应，总糖、酚酸、MBC和pH是土壤微生物特性的主要影响因子，并与微生物特性相关性显著。综上结果表明高，浓度大气CO2通过提高土壤有机化合物含量来减缓Pb污染对刺槐幼苗根际微生物的胁迫效应。

由于幼苗在生理或根系分泌物方面差别于成株，本研究所用材料为1年生幼苗，因此，分析结果限于表明树木早期阶段根际微环境对高浓度大气CO2和Pb污染的响应过程；另外，由于长期高浓度大气CO2和Pb污染可能使植物和微生物产生一定的适应性，从而影响植物根系分泌过程和微生物活动，因此有必要开展长期试验研究，以便科学揭示植物根际过程对全球气候变化联合土壤重金属污染问题的响应和反馈机制。